疏水层析在分离纯化里氏木霉重组t-PA中的应用

疏水层析是一种有效的分离纯化手段,本文采用Octyl Sepharose和Butyl Sepharose两种疏水层析填料对里氏木霉表达的t-PA的提纯操作条件进行了初步研究。结果表明,选用Butyl Sepharose FF填料,上样量10mL（蛋白含量4．1mg／mL),用15％(NH4)2SO4的PBS以2mL／min的流速进行洗脱时,回收的酶的比活性较大,为2959．54U／mg,纯化倍数为5．16,回收率为7．12％。     

用静息细胞培养法研究影响组织型纤溶酶原激活剂生物合成的因素

建立了基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)的静息细胞培养系统。确定静息细胞培养基的成分为：葡萄糖1．0g／L，尿素1．0g／L，K2HPO41．0g／L；静息细胞培养的条件为：选择发酵30h的菌体，10％的接种量，pH5．4，150r／min，28℃静息培养12h。并在该静息细胞培养系统中，研究了糖类、有机酸、氨基酸和金属离子等因素对里氏木霉306生物合成组织型纤溶酶原激活剂的影响。     

t-PA cDNA基因的克隆及测序

从基因工程菌株里氏木霉中提取基因组DNA,根据t-PAcDNA序列设计一对引物,利用PCR法扩增目的基因,将其与pMD18-T-Vector连接后转入大肠杆菌,通过Amp抗性和蓝白斑筛选出重组菌株,PCR法和双酶切法鉴定后再进行测序鉴定,测序结果表明:克隆的t-PAcDNA的第34位、450位和521位基因发生了突变。     

重组酿酒酵母r-PA发酵条件的优化

通过PCR技术对r-PA重组酿酒酵母进行了鉴定,并对该基因工程菌株生物合成r-PA的条件进行了优化。结果表明,其生物合成r-PA的最适发酵条件为:半乳糖诱导浓度为1.5%,诱导培养基起始OD600为0.3、起始pH7.0,250mL三角瓶最适装液量为60mL,诱导时间60h。优化前最高酶活为1926U/L,优化后最高酶活为5932U/L,较之提高了2倍。     

培养基组成对里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影响

通过改变产酶培养基中的营养成分与比例,采用酶活力测定方法,分析培养基中的碳源种类和浓度、氮源组成、碳氮比(mC:mN)等主要因素对里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影响。结果表明,20 g/L微晶纤维素为碳源、含氮素质量比为1∶1的硫酸铵和尿素为氮源、mC:mN=4的培养基组成,是里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳条件。在此条件下β-甘露聚糖酶酶活力在发酵96 h时达到最大,β-甘露聚糖酶酶活力和β-甘露糖苷酶酶活力分别为4.48、0.04μmol/(min.mL)。     

碳源对里氏木霉β-聚糖酶合成的影响

研究了里氏木霉β-聚糖酶的生物合成,并比较了以玉米芯、纸浆、粗木聚糖为碳源对里氏木霉β-聚糖酶诱导合成的影响。结果表明:里氏木霉以15 g/L的玉米芯为碳源合成β-聚糖酶,培养4 d时滤纸酶活、羧基纤维素(CMC)酶活、纤维二糖酶活和木聚糖酶活分别为1.03 FPIU/mL、0.54、0.08和149.7 IU/mL;以纸浆为碳源,可得到较高纤维素酶活、较低木聚糖酶活的β-聚糖酶;以粗木聚糖为碳源,可制备低纤维素酶活的木聚糖酶,木聚糖酶活与CMC酶活的比值高达785.4,适合于纸浆的生物漂白。     

碳源及氮源Trichoderma reesei306对组织型纤溶酶原激活剂生物合成的影响

本文对不同种类的碳．氮源对Trichoderma reesei306组组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)生物合成的影响进行了研究。结果表明：在所试的各种碳氮源中，碳源以玉米粉和纤维素，氮源以尿素和胰蛋白胨效果最好，通过正交试验确定了液体发酵培养基中碳氮源的最佳组成为：玉米粉20g／l、纤维素30g／l、尿素10g／l、胰蛋白胨2g／l，优化碳氮源后t—PA酶活提高了26％。     

纸浆浓度及分批补料对里氏木霉产纤维素酶的影响

研究了摇瓶中不同浓度纸浆为碳源对里氏木霉产纤维素酶的影响.结果表明:最佳的碳源质量浓度为12g/L,在此条件下第3天的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为1.68、0.96和0.28U/mL.总碳源为15g/L下采用分批补料技术可以有效提高里氏木霉分泌纤维素酶.使用起始纸浆浓度为9g/L,第2、3、4天分别加入2g/L纸浆,其第3天的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活分别为2.41、0.72和0.27U/mL,较15g/L纸浆为碳源分批培养滤纸酶活提高1.8倍.     

里氏木霉和酵母菌混合发酵玉米秸杆的研究

对里氏木霉和酵母菌混合发酵秸杆提高其粗蛋白含量的发酵工艺进行了研究。结果表明其发酵最优工艺条件 :以尿素作为氮源 ,里氏木霉接种 2 4 h后接种假丝酵母 ,接种量比例为 1∶ 4 (酵母∶里氏木霉 ) ,于 p H3.0 ,30℃下培养 4 d。粗蛋白含量可达 30 .5 5 % ,粗纤维转化率可达 33.5 %。     

间歇出酶对里氏木霉产纤维素酶的影响

在分批补料的基础上,采用间歇出酶的方法,对里氏木霉产纤维素酶进行了研究。结果表明:分批补料过程中最佳的补料速度为5.5 g/(L·d),在此条件下产酶第8天滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力达到14.40 U/mL和1.59 U/mL。在分批补料的基础上进行间歇出酶,与对照相比,第4、6、8天出酶模式(模式1)时,总滤纸酶活力提高18.14%; 第4、7天出酶模式(模式2)时,总滤纸酶活力提高17.75%; 第5、8天出酶模式(模式3)时,总滤纸酶活力提高27.35%。研究表明,通过间歇出酶可以有效提高纤维素酶总滤纸酶的活力。     

里氏木霉木聚糖酶的分离纯化及其性质

使用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶色谱脱盐、DEAE-Sephadex A-50和SP-SephadexC-50离子交换色谱等分离纯化技术，从里氏木霉（Trichoderma reesei）RutC-30培养液中分离出木聚糖酶组分，再经SephadexG-100凝胶过滤色谱进一步分离纯化，得到2个纯木聚糖酶组分A组和组分B。经SDS-PAGE鉴定两组分为单带，相对分子质量分别为20300和13500。组分A的最适反应条件为45℃、pH3.0-5.5很稳定，酶解产物主要是低聚木糖，只含少量木糖；组分B的最适反应条件为55℃、pH5.5，酶解产物全部是低聚木糖。     

初始pH对合成木聚糖酶和纤维素酶的影响

以里氏木霉（Trichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌，研究了不同初始pH值对木聚糖酶和纤维素酶合成的影响。结果表明，初始pH较低有利于纤维素酶的合成，初始pH值高则延长了产木聚糖酶的时间，且强烈抑制纤维素酶的合成，致使木聚糖酶活与纤维素酶活的比值提高，从而有利于选择性合成木聚糖酶。初始pH值分别为４．０、４．４、４．８、５．４、６．０时，培养72h，木聚糖酶活与纤维素酶活的比值分别为259、327、425、865、1016。随着初始pH值的增加，里氏木霉对培养液中还原糖的消耗能力在降低，初始pH值在4．0－4．8范围内，培养48h时还原糖浓度到最低，并且维持在低浓度的水平上。当初始pH值在5．4－6．5范围内，培养72h时还原糖浓度才达到最低，并且培养液中还原糖浓度较高，初始pH值提高到6．5时，培养液中还原糖浓度维持在较高水平上，抑制了木聚糖酶和纤维素酶的合成。     

液态混合菌发酵优化纤维素酶组分

在里氏木霉和黑曲霉液态混合条件下培养纤维素酶,分析两个菌种的接种比和延迟黑曲霉的接种时间对产酶的影响,探讨两个菌种发挥协同作用的最佳条件。结果表明:黑曲霉延迟接种48 h及里氏木霉与黑曲霉接种质量比1∶1时,所产纤维素酶的滤纸酶活为1.163μmol/(min.mL);β-葡萄糖苷酶活为0.606μmol/(min.mL),β-葡萄糖苷酶活与滤纸酶活比值为0.521,比单一里氏木霉产纤维素酶的酶活高,并在后续的酶解效果对比中表现最佳。48 h时的酶解得率为65.61%,高于里氏木霉单一培养时所产纤维素酶的得率53.91%和商品纤维素酶的得率49.64%。说明通过混合发酵,纤维素酶的组分得到了优化。     

Trichoderma reesei纤维素水解酶的糖苷合成性质

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(从(Trichoderma reesei天然纤维素水解酶中分离纯化得到了一种相对分子质量约为65 000的蛋白组分.分别以pNP-Glu、pNP-Gal、oNP-Gal和Avicel作为底物,均检出该组分的水解活性.此外该酶对CMC-Na有可被测出的弱活性.以pNP-Glu为底物,45℃时,其水解酶性质的米氏常数Km=3.04 mg/mL,Vmax=3.77 μmol/min.用DNS法和对硝基苯酚法(仅对含有对硝基酚结构的底物pNP-Glu、pNP-Gal和oNP-Gal)分别检测了在180 min反应时段内产物还原糖和对硝基苯酚的含量变化,结果显示在封闭的反应体系中有明显的可逆反应存在,并出现了周期性振荡的特征,有糖苷合成活性的表现,水解产生还原糖和对硝基苯酚的量,呈现出分别为25.43±8.34 min和36.25±2.50 min的含量增减振荡周期.与此同时,为了证实该酶糖苷合成活性的存在,以葡萄糖作为底物与酶反应,得到了7.00±4.83 min的葡萄糖含量周期性波状振荡结果.对底物为pNP-Glu反应15 min后的产物作乙酰化处理GC/MS分析,结果产物中有含二糖结构的产类型,揭示了这个水解酶的糖苷合成的特点.这是首次从Trichoderma reesei纤维素水解酶中分离得到了具有糖苷合成活性的酶.     

里氏木霉液体发酵选择性合成果胶酶

在摇瓶液体发酵的条件下研究了碳源、氮源、酵母汁和营养盐等因素对里氏木霉选择性合成果胶酶的影响规律,并测定了酶学性质。结果表明:从经济角度考虑宜选用脱汁橘皮粉制备果胶酶;在Mandels营养盐中添加1.0 g/L蛋白胨适合于里氏木霉产果胶酶;以25 g/L脱汁橘皮粉液体发酵48 h,果胶酶活力最高值达到32.6μmol/(min.mL),其中纤维素酶和木聚糖酶的活力被分别控制在0.18、0.63μmol/(min.mL)。该果胶酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃,以16μmol/(min.g)的果胶酶振荡水解10 g/L商品果胶粉50 h,酶解得率达80.3%。高效液相离子色谱的分析结果显示果胶酶的主要水解产物为单体半乳糖醛酸,含量达总水解产物的82.5%以上。     

利用里氏木霉生物转化制备黄姜薯蓣皂甙元的清洁新工艺

基于清洁生产和资源综合利用的理念, 提出一种从盾叶薯蓣根茎中提取薯蓣皂甙元的新工艺。该工艺由两部分组成, 第一部分利用淀粉酶和糖化酶分离黄姜根茎中的淀粉, 第二部分利用里氏木霉转化糖渣 中的皂苷制备薯蓣皂甙元。研究表明, 与直接酸水解相比, 新工艺可以提取约 98.7%薯蓣皂甙元, 并以还原糖 的形式回收98. 0% 淀粉, 降低生产废水中 99. 4%COD, 100% SO^2-₄ 和100% 酸。在酸水解废水中检测到24 种有机物, 其中邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸-2-乙基己酯属于美国环保局优先控制污染物。而新工艺废水中仅检测到两种有机物(17β-羟基雄甾-5-烯-3-酮和邻苯二甲酸二异丁酯) 。本研究为皂素清洁生产提供了一种新方法。     

组织型纤溶酶原激活剂突变体基因转染细胞株的建立

以脂质体介导法将含有t-PA突变基因的真核表达载体pCSRA及pCSRK分别转染CHO-dhfr^-,经G418及DMEM双重选择,获得两者的稳定表达细胞株。结果表明,表达产物具有良好溶纤活性;Western印迹实验证明,产物具有特异抗原性;经多次传代,细胞株具有良好的稳定性。比较了无血清培养基CHO-S-SFMⅡ与常规培养基DMEM培养条件下pCSRK细胞株产物的表达量,前者约为后者的2倍,表明无血清培养基SFM有可能用于药用性蛋白的生产。实验为t-PA新型突变体的临床应用打下一定基础。