Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞体外成脂、成骨分化的研究

观察体外定向诱导Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞（BMSCs）分化为脂肪细胞和成骨细胞.建立去卵巢骨质疏松山羊动物模型,全骨髓法分离培养其骨髓基质细胞.第二代细胞分别成脂、成骨诱导培养,油红O染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色判定其分化结果.成脂诱导21 d,油红O染色有脂滴形成;成骨诱导14 d,碱性磷酸酶染色阳性;连续诱导35 d,茜素红染色证实有钙化结节形成.Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞在体外可以定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞.     

大鼠骨髓基质干细胞分离培养及向成骨、成脂诱导分化的研究

目的利用细胞原代及传代培养技术将大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,为其进一步应用奠定基础.方法全骨髓法分离大鼠骨髓基质干细胞,传代后分别在成骨、成脂诱导条件下继续培养,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色及油红"O"染色观察其成骨及成脂分化结果.结果第2代大鼠骨髓基质干细胞成骨诱导9 d后碱性磷酸酶染色呈阳性细胞,连续诱导14 d后可见矿化结节形成,成脂诱导14 d后可见脂肪细胞形成.结论随着诱导条件的不同,大鼠骨髓基质干细胞在体外可定向分化为成骨细胞和脂肪细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及分化潜能鉴定

用全骨髓贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)。为鉴定其成骨分化潜能,将大鼠BM-MSCs进行成骨诱导培养,第7天用碱性磷酸酶染色显示有碱性磷酸酶阳性细胞,第21天进行茜素红染色有矿化骨节形成。为鉴定其成脂分化潜能,将大鼠BM-MSCs先在成脂诱导培养基中培养,再换为在成脂肪维持培养基中培养,第10天进行油红O染色有脂滴形成。表明从SD大鼠骨髓中成功分离得到具有多向分化潜能的大鼠BM-MSCs,为其作为种子细胞应用于临床或研究奠定基础。     

大鼠骨髓基质细胞体外定向诱导成骨

将大鼠骨髓单细胞悬液静置培养36h，利用骨髓基质细胞贴壁能力强的特点对其进行纯化和扩增培养。采用爬片培养、HE染色、组化染色以及碱性磷酸酶活性和钙含量测定等手段研究培养骨髓基质细胞的形态、分化和分泌基质情况。结果表明，非诱导培养条件下骨髓基质细胞呈梭形，部分传代细胞中可观察到脂肪细胞和肌细胞。经成骨性诱导培养后，骨髓基质细胞发生明显的形态学变化，碱性磷酸酶活性上升，钙含量增加，最终形成典型的矿化结节。提示培养大鼠骨髓基质细胞具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，但其分化成骨的潜能最为强大。本实验诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞的模式有可能适用于骨组织工程研究。     

TNF-α缺失小鼠前脂肪细胞成脂分化特征

分离培养肿瘤坏死因子α(TNF-α)缺失与野生(WT)型小鼠前脂肪细胞,诱导其成脂分化,观察成脂相关蛋白的时序性变化,探讨TNF-α缺失小鼠前脂肪细胞成脂分化特征。结果表明,TNF-α缺失小鼠前脂肪细胞诱导后第14 d,油红O染色阳性细胞显著多于WT小鼠细胞(p<0.05);成脂分化过程中,脂联素与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)表达水平逐渐上调,且TNF-α缺失小鼠前脂肪及成熟脂肪细胞表达量高于WT小鼠细胞。提示TNF-α缺失可上调前脂肪细胞分化过程中脂联素与PPARγ的表达,促进其成脂分化。     

成骨细胞诱导骨髓基质细胞体外成骨的初步研究

目的:探讨在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞(Osteoblast,OB)与骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)混合培养时,成骨细胞提供的成骨微环境能否在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,并复合支架形成成熟的骨组织.研究成骨细胞诱导BMSCs有效成骨的最小比值(指成骨细胞与骨髓基质干细胞数量的比值).方法:SY别培养SD乳鼠的成骨细胞与SD大鼠的BMSCs,将成骨细胞和BMSCs以1:9、2:8、3:7、1:0的不同比例进行混合培养,通过测定第3、6、9天培养液上清中的碱性磷酸酶(ALP)的含量,研究成骨细胞促BMSCs有效成骨的最小比值.将两种细胞以该最小浓度比混匀接种于涂附Ⅰ型胶原壳聚糖材料支架上(直径9 mm,高3mm)作为混合培养组,相同终浓度的单纯成骨细胞和单纯BMSCs分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照.另设置低比值成骨细胞对照组(仅含有共培养组中相同的成骨细胞数,但不含有共培养组中的BMSCs).全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生骨进行评价.结果:成骨细胞和BMSCs以3:7的比例进行混合培养时已可实现有效成骨.3:7比例的混合培养组及阳性对照组(成骨细胞组)体外培养8周后大体观察和苏木素-伊红染色(HE)、ALP染色基本相同,均表达骨特异性细胞外基质Ⅰ型胶原,形成了较成熟的骨组织.阴性对照组(单纯BMSCs组)和低比值成骨细胞组,原细胞支架复合物变小、变形.低比值成骨细胞组在局部形成了少量的骨组织,阴性对照组(单纯BMSCs组)未能发现骨样组织形成.结论:在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞提供的成骨微环境能够在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织.混合细胞中成骨细胞与BMSCs的比例为3:7时是有效成骨的最小比值.     

全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。     

成人骨髓间充质干细胞体外扩增和定向诱导分化为骨和软骨细胞的研究

体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSC)向骨细胞和软骨细胞分化.从正常成人骨髓中分离MSC,经纯化和扩增后分别用地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导MSC向成骨细胞分化;用无血清培养基和转化生长因子-β诱导MSC向软骨细胞分化;诱导期间用光镜检测分化情况,并通过细胞化学和免疫组化方法检测钙沉积、碱性磷酸酶、软骨细胞分泌的酸性蛋白聚糖以及Ⅰ和Ⅱ型胶原表达情况.5.5×105个成人骨髓MSC在体外扩增15代后可获得7.5×1012个细胞,扩增约1.36×107倍;在地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导培养的第7天,光镜下可观察到少数细胞逐渐由梭形变成多角形,碱性磷酸酶呈阳性,于培养的第21天可观察到钙沉积,Ⅰ型胶原呈阳性反应.成人MSC在无血清培养基中和TGF-β诱导下可向软骨细胞分化,阿茜蓝染色可观察到蓝染的酸性蛋白聚糖,Ⅱ型胶原呈阳性反应.因此,成人骨髓MSC在体外可定向诱导分化为骨细胞和软骨细胞.     

mTOR在人脂肪源间充质干细胞成脂中的作用

通过探讨mTOR对hADSCs成脂的影响,为脂肪分化异常所致疾病的预防和治疗提供参考.针对通过吸脂术所抽取的人腹部脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化分离培养hADSCs,三联诱导法使其向脂肪细胞分化,油红O染色鉴定.通过免疫细胞化学染色法检测mTOR在细胞内的分布变化;观察雷帕霉素抑制mTOR后hADSCs成脂能力的变化,即油红O染色及PPARγ的表达.结果表明,所分离细胞为平行排列、生长形态相对均一的梭形细胞.三联诱导法诱导7d后可见脂滴的出现,油红O染色着红色.mTOR的分布在分化过程中由核内转向胞浆.雷帕霉素处理细胞使细胞内脂滴的蓄积显著减少、PPARγ表达降低.雷帕霉素抑制mTOR表达可降低hADSCs的成脂能力.     

玉柏石松中甾体化合物对体外培养成骨细胞活性的影响

为研究玉柏石松中甾体化合物豆甾烷-3-酮-21-羧酸（SA）对体外培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1活性的影响,用Alamar Blue法检测了成骨细胞增殖率,碱性磷酸酶试剂盒检测了细胞中碱性磷酸酶活性,茜素红染色检测了成骨细胞矿化水平,荧光定量PCR检测了成骨细胞骨分化相关基因的表达.结果显示：8μmol/L和16μmol/L的SA处理细胞8 d能抑制成骨细胞碱性磷酸活性;处理细胞16 d能提高骨细胞矿化水平.SA抑制成骨早期分化相关基因（Runx-2和Osterix）的表达,促进骨基质蛋白OPN和骨重建相关转录因子（Jun-D,Fra-1和Fra-2）的表达.故SA具有促进骨折愈合的成骨活性,可能通过促进相关转录因子表达,骨折断面旧骨的吸收和骨基质钙化等方式完成.     

玉柏石松中甾体化合物对体外培养成骨细胞活性的影响

为研究玉柏石松中甾体化合物豆甾烷-3-酮-21-羧酸(SA)对体外培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1活性的影响,用Alamar Blue法检测了成骨细胞增殖率,碱性磷酸酶试剂盒检测了细胞中碱性磷酸酶活性,茜素红染色检测了成骨细胞矿化水平,荧光定量PCR检测了成骨细胞骨分化相关基因的表达.结果显示:8μmol/L和16μmol/L的SA处理细胞8 d能抑制成骨细胞碱性磷酸活性;处理细胞16 d能提高骨细胞矿化水平.SA抑制成骨早期分化相关基因(Runx-2和Osterix)的表达,促进骨基质蛋白OPN和骨重建相关转录因子(Jun-D,Fra-1和Fra-2)的表达.故SA具有促进骨折愈合的成骨活性,可能通过促进相关转录因子表达,骨折断面旧骨的吸收和骨基质钙化等方式完成.     

miR-494靶向TLR-4通路在骨质疏松发病中的作用及机制

目的 探究miR-494在骨质疏松大鼠中的表达及其调控机制。方法 选取30只8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠,构建骨质疏松大鼠模型。双能X线吸收仪测定骨密度。ELISA检测大鼠血清中骨钙素(BGP)和总碱性磷酸酶(TALP)含量。分类培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。qRT-PCR检测miR-494和TLR4 mRNA的表达。Western blot检测TLR4蛋白的表达。双荧光素酶报告基因验证miR-494与TLR-4的靶向关系。CCK8实验检测各组BMSCs的增殖能力。茜素红S染色检测各组BMSCs成骨分化情况。油红O染色检测各组BMSCs成脂分化情况。结果 和NC组相比,OP组大鼠骨密度、BGP含量、细胞增殖能力、矿化结节数均显著降低,TALP含量、miR-494和TLR4的表达、脂肪细胞数均显著升高(P<0.05)。和OP组相比,OP+miR-494 inhibitor组大鼠骨密度、BGP含量、细胞增殖能力、矿化结节数均显著升高,TALP含量、miR-494和TLR4的表达、脂肪细胞数均显著降低(P<0.05)。和OP+miR-494 inhibit...     

猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导

脂肪间充质干细胞(AMSCs)是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞．近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景．猪是一种比啮齿类等更接近人类的动物,具有较强的脂肪沉积能力．文中探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件．采用I型胶原酶消化分离脂肪基质微管成分(SVF),传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记．取第5代AMSCs,以含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠的培养基诱导培养,光学显微镜下观察,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变．分化细胞碱性磷酸酶(AIP)染色呈阳性,RT-PCR检测到I型骨胶原(COL-I)和骨钙素(OCN)表达,结果表明可以从SVF中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度．经流式细胞仪检测,其CD105和CD44表达呈阳性,CD14,CD34,S-100,HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向成骨细胞分化．     

肥胖与非肥胖小鼠间充质干细胞成脂分化

分离培养瘦素受体基因突变型(db/db)和野生型(Wild Type,WT)小鼠原代间充质干细胞(Mesenchymal StemCells,MSCs);采用油红O染色和异丙醇萃取法分析不同分化时期细胞中脂质积累和成脂诱导率;免疫印迹检测PPARγ和脂联素蛋白水平。结果表明,db/db小鼠MSCs通过下调脂联素和PPARγ的表达抑制成脂分化过程;db/db小鼠和WT小鼠的脂肪细胞分化过程存在差异。     

The mechanism of adipocyte differentiation and regulation of hematopoietic microenvironment

在人体生长发育与衰老过程中骨髓会逐渐由红骨髓转变成为黄骨髓,即骨髓脂肪化,其本质是骨髓中脂肪细胞增多.骨髓脂肪细胞对造血微环境具有负性调节作用,能抑制骨髓造血、抑制造血重建时造血干细胞在骨髓中的植入.深入研究骨髓脂肪化机制对促进某些疾病过程中造血恢复、提高造血干细胞移植效率具有一定意义.脂肪细胞的形成主要包括间充质干细胞向前体脂肪细胞的定向分化及其终末分化两个阶段.本文主要阐述细胞形态变化和细胞外基质通过WNT和RHO-family GTPase信号级联通路调节前体脂肪细胞的定向分化,成脂刺激因素通过PPARγ的表观遗传学途径诱导前体脂肪细胞的终末分化,以及PPARγ和C/EBP的相互作用维持脂肪细胞的基因表达.     

猪前脂肪细胞增殖与分化的初步观察

从新生仔猪颈部皮下采集脂肪组织,用胶原酶Ⅳ消化分离前脂肪细胞,于37℃,5%CO2、饱和湿度下培养前脂肪细胞,通过MTT法、油红O染色及脂蛋白脂酶(LPL)活性测定对培养细胞进行鉴定.结果表明:培养3 d后,细胞增殖进入对数增长期,其生长曲线呈S形;分化的脂肪细胞内充满脂肪滴,细胞形态由梭形逐渐变为圆形;随着前脂肪细胞的分化,LPL活性显著下降.     

长白猪骨髓和脂肪间充质干细胞复制性衰老过程中生物学特性和抗氧化损伤能力的比较

为研究对比长白猪骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adiposederivedmesenchymalstemcells,AMSCs)在体外衰老过程中的生物学特性和抗氧化损伤能力,分别利用贴壁筛选法、Ⅰ型胶原酶消化法分离获得BMSCs和AMSCs,利用流式细胞术鉴定细胞,EdU检测细胞增殖能力,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测基因表达,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)染色检测细胞衰老情况,油红O和茜素红染色检测细胞的成脂和成骨分化能力,TUNEL检测细胞的凋亡情况．分离的BMSCs和AMSCs均高表达CD44和CD90,不表达CD45和CD34．与AMSCs相比,P8代BMSCs增殖能力强,OCT4和Ki67表达高,β-gal阳性细胞数少,成骨分化能力高．但在成脂分化能力方面,AMSCs强于BMSCs．进一步发现H2O2处理P8代细胞时,AMSCs比BMSCs对氧化损伤更敏感,细胞凋亡率显著增加,究其原因可能与抗氧化损伤基因表达的显著降低有关．     

碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物学效应

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓基质细胞(BMSC)粘附、增殖和分化等生物学效应的影响.方法利用体视学计数、MTT法及ALP试剂盒分别测定不同浓度bFGF诱导一定时间后BMSG的粘附特性、增殖和分化情况的变化.结果10n/mLbFGF明显促进BMSG的粘附,但是200ng/mLbFGF反而不利于细胞粘附;在细胞增殖和分化测定中,100ng/mLbFGF明显促进细胞增殖,但细胞碱性磷酸酶含量也最低.结论碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的生物效应是复杂和多方面的,可以作用于骨髓基质细胞的粘附、增殖和分化等多个环节,这种影响与碱性成纤维细胞生长因子的剂量有关.     

人成骨样细胞SaOS-2向成骨分化过程中GNAS1基因的表达变化

目的:对成骨分化过程中GNAS1基因的表达进行研究.方法:对人成骨样细胞Sa OS-2进行成骨定向分化,采用茜素红染色、实时定量PCR和免疫印迹检测成骨分化效果和分化过程中GNAS1的表达变化.结果:实时定量PCR结果显示,RUNX2基因在成骨分化第3天表达最高,之后呈下降趋势,而实时定量PCR和免疫印迹均检测到GNAS1基因在成骨分化第3天表达最低,之后呈升高趋势.结论:GNAS1基因在成骨分化过程中表达存在差异,提示对成骨细胞分化具有调控作用.