PDXl与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上,替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4;双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒,然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒,并进行病毒滴度测定;体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;而RTPCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体,转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。     

过表达IL-8受体对脐带源间充质干细胞生物活性的影响

目的探究腺病毒介导的IL-8受体过表达对脐带源间充质干细胞生物活性的影响。方法本研究利用含有IL-8RA和IL-8RB的c DNA和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒载体(p Ad-IL-8RA-GFP、p Ad-IL-8RB-GFP和p Ad-Null-GFP)分别转染分离培养的P3-5代脐带源间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测干细胞标签蛋白CD29、CD44、CD34、HLA-DR的表达,CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力,粘附实验及Transwell趋化实验观察过表达IL-8RA/B的脐带源间充质干细胞的迁移能力。结果脐带源间充质干细胞形态均一、生长状态良好;干细胞特异性相关蛋白CD29、CD44阳性表达,CD34、HLA-DR阴性表达;与对照组比较,IL-8RA/B过表达的脐带源间充质干细胞的增殖能力无明显改变,但是过表达IL-8RA/B的间充质干细胞粘附在损伤内皮上以及迁移到小室下方的细胞数目更多。结论以上结果表明IL-8RA/B的过表达不影响脐带源间充质干细胞的增殖能力,但是能够促进脐带源间充质干细胞向IL-8趋化和向损伤内皮细胞粘附。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

靶向hTERT的shRNA腺病毒载体的构建及其对MCF-7细胞hTERT表达的影响

设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT,构建siRNA表达质粒PgenesilhTERT;随后将shRNA表达框克隆到入门载体pENTRTM1A,构建重组质粒pENTR/U6-hTERT-polyA;使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,得到重组腺病毒质粒pAd/U6 –TERT-polyA;线性化的重组腺病毒质粒在HEK 293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒rAd-hTERT.同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照rAd-HK,空病毒对照rAd-blank和只含EGFP的rAd -EGFP.四种病毒经酶切、电泳分析表明插入序列正确,腺病毒载体构建成功.Western blotting测定转染后各组hTERT蛋白的表达情况,证实转染rAd-hTERT 48 h后,hTERT的表达明显被抑制.实验表明基于Gateway技术的腺病毒介导的shRNA载体构建成功,rAd-hTERT可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT基因的表达.本研究为针对端粒酶的基因治疗奠定了实验基础.     

同工异源酶基因forp与genp异源表达的研究

来自绛红色小单孢菌G1008的genp与来自橄榄星小单孢菌FOM808的forp,均参与3’,4’-双脱羟基,2个基因属于同工异源酶基因.应用同源重组原理,实现forp替换genp,探索同工异源酶基因异源表达的可能性.以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建同源重组质粒pFP4.经接合转移将载体导入到G1008基因组中,利用影印筛选和PCR验证的方法,获得基因重组工程菌FTP2.提取工程菌次级代谢产物,经TLC和MS分析.结果表明,工程菌仍然可以产生庆大霉素C组分.forp基因的功能得到了体现,外源基因forp实现了异源表达,进一步证实forp是负责参与3’,4’-双脱羟基的功能基因.     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

ING4及IL-24双基因共表达腺病毒载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用研究

目的用人肿瘤生长抑制因子(mING4)及人白介素24(IL-24)基因构建腺病毒双基因共表达载体(Ad-ING4-IL-24),并设Ad-ING4和Ad-IL-24单基因对照,研究双基因共表达载体对MG-63人骨肉瘤细胞体外抑癌增效作用.方法首先将已构建成功的Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4及Ad-IL-24腺病毒感染QBI-293A细胞,经多轮扩增后获得高滴度的病毒子,测病毒效价后分别以100 MOI剂量感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING-4及IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法检测ING-4及IL-24基因表达对MG-63细胞的生长抑制效应;半定量RT-PCR法检测ING4及IL-24基因表达对MG-63细胞中的Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34等相关基因表达的影响.结果获得了高滴度的重组腺病毒Ad-ING4-IL-24,Ad-ING4,Ad-IL-24和Ad-GFP;治疗后MG-63细胞中ING-4及IL-24双基因表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,ING-4及IL-24基因表达可通过上调细胞中Bax,Caspase3,p21和下调Bcl-2,CD34基因表达诱导细胞凋亡.在病毒子剂量为100 MOI时,Ad-ING4-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑制作用比对Ad-ING4和Ad-IL-24抑制效果更为显著.结论腺病毒介导的ING4或/和IL-24基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,且Ad-ING4-IL-24双基因比Ad-ING4和Ad-IL-24单基因的抑制效果更为显著,该现象可能是通过改变Bcl-2,Bax,Caspase3,p21,CD34基因表达水平来发挥抗肿瘤作用的.     

BMSCs过表达BMP-4复合同种异体骨修复软骨缺损

目的 针对关节软骨损伤后修复困难,采用腺病毒(Ad)载体介导骨形态发生蛋白(BMP-4)修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs),并复合同种异体骨软骨柱支架,以期实现关节软骨有效再生.方法 制备同种异体骨软骨柱,BMSCs过表达BMP-4复合同种异体骨修复关节软骨损伤,膝关节标本取材大体观察及分析,HE、番红固绿、Masso...     

构建重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1及在胃癌细胞SGC-7901中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并观察其在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及对SGC-7901活性的影响.方法:通过RT-PCR法扩增不可降解CyclinB1(ND CyclinB1),将其插入到pEGFP-N1载体的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并以PCR、双酶切、测序鉴定.通过脂质体法转染胃癌细胞SGC-7901,进行荧光检测、Western blotting分析和流式细胞仪分析.结果:PCR、酶切及测序证明重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1构建成功.转染胃癌细胞SGC-7901 24 h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光.Western blotting检测到CyclinB1的表达明显增加.流式细胞仪检测重组质粒细胞组凋亡指数高于对照组,差异有显著性.结论:成功构建pEGFP-N1-ND CyclinB1荧光真核表达载体,并可在SGC-7901细胞中有效表达.     

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化.根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因.合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化.成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和western-h1ot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶.获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础.     

《梁山伯与祝英台》与《罗密欧与朱丽叶》调式比较

《梁山伯与祝英台》与《罗密欧与朱丽叶》两部作品的内容都取材于民间故事,都属于标题性音乐作品,作品曲式结构基本相同。不同之处是对造成悲剧原因的展示有着明显区别,主、副部主题的表现和运用截然相反,音乐的主基调有较大差异,作品的整体风格迥异。     

有氧运动与身心健康探析

健康与运动是密不可分的,运动分为有氧和无氧,有氧运动较无氧运动更易普及和被大众接受,从人体长期参加有氧运动对人的身体健康和心理健康的角度来阐述有氧运动对人体的良好影响。     

道教与魏晋南北朝文人的功利欲望

欲望是作家创作的内驱力,道教对中国古代文人的欲望有什么影响,这是研究中国古代文学和文学理论不能不思考的问题。本文从道教的功利性,文人纷纷走近道教,文学观念中的道教因素等方面,对道教与魏晋南北朝文人的功利欲望作些专门探讨。这无疑会拓展人们研究的新视界。     

我国的沙暴、尘暴及其防治

我国是沙尘暴易发的国家 ,进入９０年代以来 ,沙尘暴有频率增加、强度加大、范围扩展、危害程度加剧的趋势。据统计 ,我国发生强沙尘暴的次数 ,５０年代为５次 ,６０年代为８次 ,７０年代为１３次 ,８０年代为１４次［１］ ,９０年代为２３次［２］ ,呈明显上升趋势。沙尘暴的强度及造成的损失 ,以９０年代最为突出 ,发生于１９９３年５月５日（５．５沙尘暴）和１９９８年４月１６日（４．１６沙尘暴）的特大强沙尘暴 ,是我国近１００年来所罕见 ,损失极其惨重。５、５沙尘暴锋面前移速度１４～１７米／秒 ,最大１９．５米／秒 ,瞬时最大风…     

我国的沙暴、尘暴及其防治

 我国是沙尘暴易发的国家, 进入90年代以来, 沙尘暴有频率增加、强度加大、范围扩展、危害程度加剧的趋势。据统计, 我国发生强沙尘暴的次数, 50年代为5次, 60年代为8次, 70年代为13次, 80年代为14次[1], 90年代为23次[2], 呈明显上升趋势。沙尘暴的强度及造成的损失, 以90年代最为突出, 发生于1993年5月5日(5.5沙尘暴)和1998年4月16日(4.16沙尘暴)的特大强沙尘暴, 是我国近100年来所罕见, 损失极其惨重。     

辽金诗文话语与佛禅

辽金诗文作品中存在着大量的由佛经禅典移植而来的话语。这一现象从特定侧面体现了佛禅对中国古代文学的渗透溶浸。其表现主要反映在借用佛禅意像、使用佛禅故实和引用佛禅语汇三方面。     

高校管理与师生权益的保护

当前,因高校管理引发的法律纠纷呈上升趋势,究其原因是师生的法治观念在增强,另一方面说明高校在师生管理等方面也存在诸多不适应。要改变这些不适应,就要进行依法治校,更新管理理念。做到规章制度合法、管理行为合法。努力加强法制教育工作和师德校风建设,切实保障师生的合法权益。     

博客与高校思想政治教育

网络的发展为我们带来全新便捷的互动平台和交流方式,博客是当今传播文化的重要载体,因个体性、公共性、开放性、成本投入少等特点吸引着"90后"大学生广泛关注。在新形势的要求下,高校辅导员应主动占领网络博客思想政治教育新阵地,加强辅导员博客建设,根据大学生的心理特点,利用博客提升网络思想政治教育工作的吸引力和感染力,创新高校思想政治教育。     

文献信息情报工作在科技工作及立项决策中的作用

本文揭示了在当今信息市场形势下 ,文献信息情报工作在科技工作和经济立项决策中的作用 ,同时也指出 :图书馆文献信息工作者们能在强手如云的信息市场中占领一块阵地也应成为图书馆界的共识