二咖啡酰基奎宁酸MQA抗MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用研究

目的为了探讨二咖啡酰基奎宁酸(MQA)抗1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的作用及机制。方法通过建立MPP+所致的SH-SY5Y细胞损伤模型;MQA抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用研究;Western blot检测AMPKβ1/2,LC3A/B,Beclin-1蛋白的表达。结果 MPP+可造成SH-SY5Y细胞损伤,并且在MPP+浓度为2.5 mmol/L时,模型最佳;MQA具有抗MPP+诱导的细胞损伤作用,能提高细胞存活率;MQA能降低AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1蛋白的表达。结论 MQA具有抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用,其机制可能与抑制细胞自噬有关。     

β淀粉样蛋白25-35片段最佳损伤建模条件的研究

为探讨淀粉样蛋白25-35片段(Αβ25-35)诱导细胞损伤的最佳条件,为后续Αβ作用机制研究奠定实验基础。采用正常血清培养和血清饥饿培养两种预处理方法,以Αβ25-35为诱导剂,建立SH-SY5Y细胞损伤模型,通过细胞形态学和存活率两个指标来确定损伤模型建立的最佳条件。结果显示,血清在Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞损伤中具有保护作用。由此可知,采用血清饥饿法培养SH-SY5Y细胞,以40μM的Aβ25-35处理细胞48h是建立细胞损伤模型的最佳条件。     

过氧化氢对吗啡依赖的SH-SY5Y细胞内活性氧水平的影响

为探讨H2O2对吗啡依赖的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内ROS水平的影响,应用H2O2在吗啡依赖的SH-SY5Y细胞建立氧化应激损伤的实验模型,分别利用MTT法测定细胞存活率、Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡和DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平。结果表明:100-400μmol/L H2O2处理长期吗啡作用的SH-SY5Y细胞,使细胞的存活率明显降低、凋亡率显著增加,吗啡时间依赖性的诱导SH-SY5Y细胞内产生ROS,H2O2处理吗啡长期作用的SH-SY5Y细胞,使细胞内ROS水平进一步升高;NAC预处理长期吗啡作用的SH-SY5Y细胞可阻断吗啡引起SH-SY5Y细胞存活率的降低、细胞凋亡率的增加及细胞内ROS水平的升高,由此可知,NAC能明显保护SH-SY5Y细胞对抗吗啡引起的损伤,降低ROS的水平可能是NAC的细胞保护机制之一。     

樱柏酸对叔丁基过氧化氢诱导SH-SY5Y神经细胞氧化应激损伤的保护作用

采用TBHP处理SH-SY5Y细胞的方法,建立了细胞氧化应激损伤模型,用以评价樱柏酸对细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。同时借助MTS法、β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法、乳酸脱氢酶(LDH)含量检测法、Annexin V-FITC/PI双染法、2′,7′-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH-DA)法以及酶联免疫法(ELISA)法等对细胞的活性及衰老相关指标进行了检测。研究结果显示樱柏酸对TBHP诱导的SH-SY5Y氧化应激损伤细胞模型具有保护作用,并且能够降低细胞衰老比例、细胞凋亡水平,其作用机制可能通过减轻细胞膜和DNA等氧化应激损伤、提高体内抗氧化酶SOD和GSH-Px酶活力减少ROS含量起效。     

肝X受体α在小胶质细胞激活致神经元损伤中的作用研究

[目的]研究肝X受体alpha(LXRα)在小胶质细胞激活致神经元损伤中的作用.[方法]小鼠小胶质细胞株(BV2细胞)置于6孔培养板培养,分为对照组、Aβ组、干扰组、干扰+Aβ组、假干扰+Aβ组.应用倒置显微镜观察各组BV2细胞的形态学变化,Western blot方法检测LXRα蛋白表达变化,ELISA检测各组上清液中COX-2、iNOS的表达水平.收取BV2细胞上清液作为条件培养基用来培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),并通过CCK-8和免疫荧光法检测SH-SY5Y细胞的存活率和凋亡蛋白Bax表达情况.[结果]与对照组相比,Aβ组及干扰组的BV2细胞表现为胞体变圆变大,细胞突起减少,呈阿米巴样活化状态,LXRα蛋白水平明显下调(P0.05),细胞上清液COX-2,iNOS的表达含量明显升高(P0.05),Aβ处理组和干扰组的细胞上清液明显引起SH-SY5Y细胞存活率降低、凋亡蛋白Bax表达增加(P0.05).与假干扰+Aβ组相比,干扰+Aβ组的细胞胞体变大,突起减少,LXRα蛋白表达减少,COX-2,iNOS的表达增加,干扰+Aβ组的细胞上清液导致SH-SY5Y细胞存活率降低,Bax表达增加(P0.05).[结论] LXRα参与调控Aβ诱导的小胶质细胞激活及炎症因子的释放,在AD的炎症机制中发挥重要作用.     

红花黄色素对谷氨酸/过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡保护作用

为研究红花黄色素对谷氨酸/过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。将SH-SY5Y细胞随机分为正常组,模型组(谷氨酸/过氧化氢损伤),红花黄色素不同剂量组(0.01、0.1、1 g/L)。利用MTT法测定SH-SY5Y细胞存活率,Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡情况,RT-PCR法测定Bax,Bcl-2和Bcl-x m RNA表达水平。MTT实验结果显示,谷氨酸/过氧化氢诱导后的细胞生存率分别下降至51.15%和63.08%(P0.01),红花黄色素不同剂量组可以显著提高细胞存活率,且成浓度依赖性(P0.05),红花黄色素高剂量组亦可以明显降低谷氨酸/过氧化氢损伤所诱导的细胞凋亡;与模型组相比,红花黄色素能够使促凋亡基因Bax的表达显著降低(P0.05),而抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达显著增加(P0.05)。由此可知,红花黄色素对谷氨酸/过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与调节凋亡相关基因的表达有关。     

连翘酯苷A对Aβ_(25-35)聚集体引起的神经损伤的改善作用研究

阿尔茨海默病(AD)的发病与脑内β淀粉样蛋白(Aβ)的异常沉积有关。在Aβ25-35聚集体诱导的小鼠海马神经元细胞系HT22细胞炎症模型上,探究了连翘酯苷A对神经炎症损伤的改善作用。用MTT法检测了HT22细胞的存活率;用Griess Reagent法检测了HT22细胞NO的分泌量;通过荧光光谱法和透射电镜法,确定了Aβ25-35的聚集状态。1~40μmol·L-1 Aβ25-35聚集体组比单体组的细胞存活率更低、NO的释放量更多,对HT22细胞的损伤更大。此外,与Aβ25-35聚集体模型组相比,连翘酯苷A组细胞存活率得到显著提高,NO的释放量显著减少,表明连翘酯苷A对Aβ25-35聚集体引起的神经炎症损伤有明显的改善作用。     

内生真菌MG-9的主物质麦角甾醇的分离鉴定及抗氧化活性分析

从疏花水柏枝中的一株内生真菌MG-9的粗提物中重结晶出一种主物质,采用NMR、MS等现代波谱学技术鉴定这种主物质为麦角甾醇.以LDH(乳酸脱氢酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、caspase 3、caspase 9的酶活表达情况为指标,研究了MG-9主物质对神经细胞SH-SY5Y的毒害作用及抗氧化保护作用机理.结果表明:麦角甾醇在6.25-25μg/mL时对神经细胞SH-SY5Y毒性的量效关系不明显,而在6.25μg/mL时对神经细胞SH-SY5Y的氧化损伤保护具有更好的效果,将神经细胞SH-SY5Y在H_2O_2(800μmol/L)胁迫下的相对存活率提高了74.5%.并且麦角甾醇可通过抑制凋亡蛋白caspase 3的活性来达到对神经细胞SH-SY5Y的抗氧化保护作用.     

白杨素衍生物通过抑制细胞凋亡保护谷氨酸诱导的神经细胞的损伤

研究白杨素衍生物对谷氨酸诱导的神经细胞损伤的保护作用.以谷氨酸构建体外培养SH-SY5Y神经细胞损伤的模型,选择噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率;使用酶标仪,对细胞培养液中过氧化氢酶的活性和超氧化物歧化酶的活性进行检测,并对丙二醛的含量及总抗氧化能力的高低进行检测;使用Annexin V/PI的方法染色,流式细胞术对细胞凋亡率进行检测.结果:不同浓度药物(50、100、200、400μmol/L)处理可显著提高细胞存活比例,药物浓度为200μmol/L时细胞存活比例最高,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性也最高,丙二醛的含量最低,总抗氧化达到最大水平.药物浓度为100、200μmol/L,其凋亡率降低到11.39％、5.02％,较模型组的凋亡率28.06％降低了2-5倍多.白杨素衍生物对谷氨酸诱导的SH-SY5 Y神经细胞拥有效果明显的保护作用,它的作用机制或是通过抑制细胞凋亡进而达到保护作用.     

O_3氧化黑碳对SH-SY5Y细胞的毒性作用

以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为模型,在细胞体系探讨经O_3氧化过的黑碳(O_3-oxidized black carbon, OBC)颗粒对神经细胞的毒性作用.应用MTT方法评估SH-SY5Y细胞的存活率;通过测定培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LHD)浓度评估细胞膜的损伤程度;利用流式细胞术评价细胞凋亡率;使用荧光探针(Fluo 3-AM)检测细胞内Ca~(2+)浓度.结果显示, OBC颗粒对SH-SY5Y细胞暴露24和48 h的半致死浓度(IC50)分别为202.2和133.3μg/mL;随着BC颗粒染毒浓度的增加(0, 5, 10, 20, 40μg/m L),胞外LDH浓度、细胞凋亡率和Ca~(2+)浓度均逐渐升高,呈显著的剂量-效应关系(p 0.05).研究表明, OBC颗粒可导致神经细胞内Ca~(2+)浓度升高、细胞膜损坏,并最终导致细胞凋亡的发生.     

ADTIQ导致SH-SY5Y细胞凋亡和多巴胺转运体表达降低

新内源性神经毒素1-乙酰基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(ADTIQ)生成与糖代谢密切相关,可能成为糖尿病并发PD的一个关键因素,但是其神经毒性还不清楚.针对ADTIQ的神经毒性,该研究采用SH-SY5Y细胞为模型,MTT法,Annexin V/PI双染法,Caspase 3/7活性检测细胞存活率和细胞凋亡,Western-blot检测多巴胺转运体(DAT)的表达量.结果表明,随着ADTIQ浓度增大,细胞的存活率逐渐下降,凋亡率增加,同时ADTIQ导致DAT表达降低.研究提示ADTIQ导致多巴胺神经元的凋亡与PD的发生息息相关,糖尿病引起ADTIQ增加,可能成为高糖损伤多巴胺神经元的一个重要原因.     

风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖与诱导自噬作用研究

目的研究自噬在风车子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖中的作用,探讨CA4抑制血管生成的机制。方法体外培养HUVECs,采用不同浓度的CA4处理HUVECs,药物作用不同时间后用MTT法检测CA4对细胞存活率的影响,MDC染色检测10n M CA4处理不同时间自噬小体变化的情况,RT-PCR检测自噬相关基因LC3B和Beclin 1基因转录水平的变化,Western Blot检测LC3B和Beclin1的蛋白表达水平的变化。结果 CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范围呈浓度依赖性和时间依赖性;10n M CA4处理12小时和24小时自噬小体显著增加,诱导HUVECs自噬;荧光定量PCR结果显示自噬相关基因LC3Ⅰ表达下调、LC3Ⅱ表达上调,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著上调,Beclin 1表达上调;Western Blot结果与荧光定量PCR结果一致,但m TOR蛋白未见明显变化。结论 CA4能显著抑制HUVECs增殖和诱导HUVECs自噬。     

山茱萸中生物活性物质的分离、鉴定及其神经保护作用

研究山茱萸乙醇提取物中生物活性成分的化学组成及其对神经的保护作用。采用正相常压硅胶、Sephadex LH-20凝胶、大孔吸附树脂、闪式低压正反相硅胶和氰基、反相高压液相等色谱方法对显示具有神经保护活性的组分进行分离纯化,根据核磁共振谱、质谱,同时结合已知文献数据对比鉴定化合物结构;再采用H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型对分离鉴定的化合物进行体外神经保护活性测定。结果表明,从山茱萸显示神经保护活性的组分中分离鉴定了9个化合物,分别为7-β-莫诺苷(1)、7-β-O-甲基莫诺苷(2)、7-α-0-甲基莫诺苷(3)、金吉苷(4)、cornolactones D(5)、pollenfuran A(6)、threo-2,3-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol (7)、5-羟甲基糠醛(8)和3,4-二-羟基苯甲酸(9);其中化合物pollenfuran A(6)和threo-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol(7)为首次从山茱萸属植物中分离得到,化合物cornolactones D(5)为首次从山茱萸中分离得到;化合物7-β-莫诺苷(1)、7-β-0-甲基莫诺苷(2)、7-α-0-甲基莫诺苷(3)具有神经保护活性。     

虫草素对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的应用Aβ25-35孵育PC12细胞制作细胞损伤模型,探讨虫草素对PC12细胞损伤的保护作用.方法将不同组别PC12细胞用Aβ25-35诱导48 h后,采用MTT法测定细胞活力,LDH法测定细胞膜通透性,化学比色法测定细胞中SOD活性和MDA含量,Western blot法检测PC12细胞中Caspase-3的表达.结果与模型组相比,两种剂量的虫草素均使细胞存活率显著增加,细胞培养上清中LDH含量显著减少,细胞中SOD活性显著升高,MDA含量显著下降,并明显降低PC12细胞Caspase-3的表达.结论虫草素对Aβ25-35诱导的PC12细胞死亡、氧化损伤和细胞凋亡有明显保护作用.     

蛇葡萄素对结肠癌细胞增殖抑制、自噬诱导及自噬对增殖的影响研究

明确蛇葡萄素(Ampelopsin,AMP)对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制,探讨自噬活化及自噬对AMP抑制细胞增殖作用的影响,为AMP临床研究抗肿瘤作用的自噬靶点提供依据.采用CCK-8法检测AMP(0～300μg/m L)作用HCT116细胞后细胞增殖变化,确定AMP的抗肿瘤作用;慢病毒感染法构建HCT116-RFP-GFP-LC3重组细胞株研究自噬标志蛋白LC3的荧光表达,结合蛋白质印迹法检测自噬标志蛋白LC3I/II和P62的表达确定细胞自噬活化状态;通过抑制剂Baf A1阻断HCT116细胞自噬晚期降解过程,比较AMP组与AMP+Baf A1组间AMP对HCT116细胞增殖的影响明确自噬对细胞增殖的影响.结果表明:AMP(150～300μg/m L)抑制细胞增殖,表明AMP具有抗肿瘤作用;对比空白对照组,AMP(50、75μg/m L)组重组细胞出现LC3荧光点状自噬体,自噬发生率分别为26.72%、19.47%; LC3II蛋白表达上调,P62下调,表明AMP诱导细胞自噬且自噬过程完整;与AMP组比较,加入Baf A1后,LC3II、P62蛋白及自噬点均显著增加,证明自噬晚期过程被阻断,但抑制自噬晚期降解过程对AMP组与AMP+Baf A1组间细胞增殖影响不显著(P0.05),说明在实验浓度范围内,阻断自噬降解过程对细胞增殖无显著影响.结论表明:AMP(0～300μg/m L)能够抑制结肠癌细胞增殖,激活细胞自噬,且自噬晚期降解过程阻断对细胞增殖无显著影响,细胞的增殖抑制可能是通过其他途径实现.     

基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性和作用机制

基于六水合氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型,探究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性及作用机制。将受精后3 d的野生型AB品系斑马鱼随机分为阴性对照组,80μmol/L六水合氯化铝模型对照组,80μmol/L六水合氯化铝与6μmol/L多奈哌齐阳性对照组,80μmol/L六水合氯化铝与不同浓度(5、10、20μmol/L)木蝴蝶苷A受试物组。斑马鱼受精后6 d,利用明暗交替行为学实验观察不同处理组斑马鱼行为差异并分析其变化;通过硫黄素S染色测定各组斑马鱼头部Aβ斑块沉积数;采用酶活测定试剂盒检测各组斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性;以实时荧光定量PCR检测自噬相关基因(beclin1、ulk1b、ulk2和atg7)的表达变化;借助分子对接技术验证木蝴蝶苷A与自噬相关蛋白(beclin1、ulk1b、ulk2和atg7)结合的可靠性。结果表明,木蝴蝶苷A缓解了六水合氯化铝造成的斑马鱼运动障碍,降低了Aβ斑块沉积数和乙酰胆碱酯酶活性水平,使自噬相关基因的异常表达趋于正常。该研究初步揭示了木蝴蝶苷A能够缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍,其机制可能与激活细胞自噬有关,这为木蝴蝶苷A的临床应用及其治疗阿...     

琐琐葡萄多糖对PC12细胞损伤的神经保护作用

 体外培养PC12细胞,采用20μmol/L β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)作用24h诱导细胞损伤,建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型,研究琐琐葡萄多糖(VTP)对PC12细胞损伤的神经保护作用。设立对照组、模型组和VTP保护组(20,40,80μg/mL),CCK-8法检测各组细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜通透性及完整性,化学比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,20,40,80μg/mL VTP可提高PC12细胞存活率,减少LDH渗漏,增加SOD活力,减少MDA含量,降低细胞凋亡率,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。由此推论,VTP对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡和氧化损伤具有明显的保护作用。     

5十七烷基间苯二酚对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用

为研究5-十七烷基间苯二酚(AR-C17)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及其潜在机制,采用CCK-8方法检测不同处理下的细胞存活率变化;DCF-DA荧光探针法检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)变化情况;流式细胞术测定胞内肿瘤增殖标记物Ki-67的表达,细胞凋亡的变化,线粒体膜电位的变化及自噬体的形成情况;蛋白印迹法检测Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ等凋亡、自噬相关蛋白的表达情况。结果表明,与对照组相比,AR-C17显著抑制了MDA-MB-231细胞存活率,促进胞内ROS的生成,降低肿瘤增殖标志物Ki-67的表达,降低线粒体膜电位,上调Bax/Bcl-2的蛋白表达比率,增加活性Caspase的表达量,诱导MDA-MB-231细胞发生线粒体途径的凋亡;同时,AR-C17能够增加LC3-Ⅱ蛋白表达量,促进自噬体形成,诱导细胞发生自噬;此外,采用自噬抑制剂与AR-C17共同作用能够降低细胞存活率,进一步促进细胞凋亡。研究结果表明,AR-C17能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生凋亡和自噬,达到抑制乳腺癌细胞增殖的作用。     

天然Aβ寡聚体抗体的制备研究

在本研究中,制备了Aβ寡聚体和交联该寡聚体的亲和层析填料,然后应用亲和层析技术从IVIG中纯化获得了结合Aβ寡聚体的多克隆抗体(antibodies against Aβoligomer,Ab-Aβo),并应用ELISA和Western blot对其进行了鉴定,以MTT实验分析了该抗体对Aβ42诱导的细胞毒性作用的影响.结果表明,纯化获得的Ab-Aβo能特异性地结合体外合成或细胞形成的Aβ寡聚体,并且与Aβ寡聚体的结合活性比IVIG高1000倍,同时该寡聚体抗体能够显著抑制Aβ42诱导的细胞毒性.     

Ifenprodil对自噬的调控机制及其在帕金森病中的作用

为探讨Ifenprodil在帕金森病(Parkinsan's disease,PD)中自噬抑制的缓解作用,采用体内和体外两部分实验对其机制进行研究。对6-OHDA-PD大鼠模型进行随机分组给药,通过旋转试验和圆筒实验观察Ifenprodil对PD大鼠行为学改善作用,免疫组织化学法(IHC)检测中脑黑质TH阳性细胞的表达情况;采用不同浓度的Ifenprodil对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞兴奋性神经毒模型进行治疗,MTT法检测细胞存活率,Western Blot法检测膜受体NR2B和NR2A,自噬蛋白lc3b、beclin-1和p62,凋亡相关蛋白bax和bcl-2的表达水平。结果显示,Ifenprodil可改善APO诱发的异常旋转行为,对黑质多巴胺神经元具有较好的保护作用,可在动物及细胞水平上调lc3b,beclin-1,bcl-2的表达,下调p62,bax的表达。结果提示,Ifenprodil对多巴胺神经元有较好的保护作用,其机制可能与调节NMDA受体亚基的表达,增强细胞自身的自噬作用相关。