基因敲除动物模型的建立

基因敲除是 80年代后半期应用ＤＮＡ同源重组原理发展起来的一门新技术。它是指对一个结构已知但功能未知的基因 ,从分子水平上设计实验 ,将该基因去除 (ｋｎｏｃｋｏｕｔ) ,或用其它顺序相近基因取代 ,然后从整体观察实验动物 ,推测相应基因的功能。80年代初 ,胚胎干细胞分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。 1985年 ,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础[1] 。 1989年Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等通过基于ＥＳ细胞囊胚注射的基因敲除 ,建立了次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶 (ｈｒｐｔ)基因被定点剔除的小鼠模型[…     

不同转导方式及载体形式对TALENs在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究

通过同源重组进行小鼠胚胎干细胞基因敲除是目前应用最为广泛的基因敲除技术手段,但同源重组的效率却非常低.TALEs和FokI的剪切结构域融合的TALENs可以实现高效的基因敲除.已有报导表明,TALENs识别位点的DNA序列和长度,及间隔区的长短等条件影响TALENs打靶效率.但外源载体的导入方式及载体的形式(DNA或RNA)是否以及如何影响TALENs的打靶效率还不明确.用不同的转导方式将TALENs导入小鼠胚胎干细胞中,并检测TALENs切割识别位点的效率,实验发现Lipofectamine○R2000转染的TALENs比电转化能更高效地切割目的 DNA位点,而DNA质粒或体外转录的RNA表达的TALENs切割DNA位点的效率相近.数据表明,在应用TALENs进行基因敲除时,有必要选择合适的转导方式以提高突变效率.     

揭示基因组功能的强大工具:基因打靶技术——2007年度诺贝尔生理学或医学奖成果简介

基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(ES细胞)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点,其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获技术等,为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强大的工具。美国科学家Mario R. Capecchi,Oliver Smithies和英国科学家Martin J. Evans因基因打靶技术的开创性研究而获得了2007年度诺贝尔生理学或医学奖。     

纯合敲除Cyp26s基因胚胎干细胞模型的建立

基因敲除的胚胎干细胞模型在基因功能的研究中起着重要作用.为了建立一套在胚胎干细胞中简便高效纯合敲除基因的方法,以Cyp26s基因家族为例,应用CRISPR-Cas9基因修饰技术,对靶向gRNA设计、细胞筛选、阳性克隆鉴定等过程进行了优化.结果表明,通过双位点靶向gRNA设计,转染线性化的质粒,G418筛选7d,sgRNA位点外侧设计鉴定引物等策略,在4周内获得了3株纯合敲除Cyp26s基因(Cyp26a1~(-/-)、Cyp26b1~(-/-)和Cyp26c1~(-/-))的ES细胞系.     

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

国内期刊亮点

正构建黏蛋白1基因敲除小鼠模型黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视。上海交通大学程布凯等为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型。研究人员首先根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFnpBR322。以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆。挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EIIa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未     

2007年诺贝尔生理学或医学奖揭晓

瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布,将2007年度诺贝尔生理学或医学奖分别授予美国科学家马里奥．卡佩基和奥利弗．史密斯以及英国科学家马丁．埃文斯。这三位科学家之所以获奖是因为他们发现了如何操纵小鼠的胚胎干细胞基因,创造了一套完整的“基因敲除小鼠”方式,     

利用CRISPR/Cas9技术建立小鼠Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除新型胚胎干细胞系

胚胎干细胞因其具有体外自我更新以及多向分化的能力,成为研究基因功能、细胞治疗和组织再生等的有力工具.胚胎干细胞的基因敲除模型在基因功能研究中起着重要作用.我们利用实验室现有的G3-AH和tWG3II-2两种胚胎干细胞系,通过脂质体转染嘌呤霉素(puromycin)标记的PX459-sgRNA载体,使用CRISPR-Cas9技术分别构建Bdh2、Dnmt3a和Dusp9敲除的胚胎干细胞系,通过基因型鉴定、PCR产物测序、qPCR和Western Blot等实验得到Bdh2、Dnmt3a和Dusp9纯合缺失的胚胎干细胞系.之后,qPCR、免疫荧光染色分别检测了Bdh2、Dnmt3a和Dusp9缺失的胚胎干细胞中多能基因、DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因表达变化.另外,通过嵌合体制备方法检测Dusp9基因敲除对胎儿卵黄囊(yolk sac)和胎盘(placenta)等发育的影响.实验结果表明,KO细胞系中分别敲除的基因(Bdh2、Dnmt3a和Dusp9)在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(p0.05),且不同程度地影响了DNA甲基化相关基因和胚层分化相关基因的表达.Dusp9KO嵌合体结果显示,Dusp9KO均能贡献到胎儿及卵黄囊,但是,能否贡献到胎盘尚待进一步深入探究.本研究成功获得纯合敲除Bdh2、Dnmt3a和Dusp9基因的胚胎干细胞系,为研究Bdh2、Dnmt3a和Dusp9三种基因在胚胎干细胞中的作用提供了重要依据.     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

ELT in 2015 in China

本文推测了中国未来英语教学的状况。文章简要介绍了中国目前使用的英语教学法;在未来的十年中,英语的教和学可能产生的变化;探讨了学生可能产生的变化及他们学习英语原因的变化;英语语言及网络的发展可能对中国的英语教育产生的影响;以及英语教师们如何看待未来他们的工作。     

k-因子的哈密顿性质

借助Bauer定理给出了一个猜想的简短证明：如果图G含有k-因子且是2-连通的,并满足σ２（Ｇ）≥ｎ－ｋ,那么图G是哈密顿的.     

论战后日本体育课程目标的发展变化

通过文献资料法,对战后日本历次颁布的体育教学大纲进行研究,对大纲中的课程目标进行历史分期,归纳起来,战后日本现代体育课程目标大致可划分为六个时期:(1)强调生活目标时期(1945—1957年);(2)强调基础运动能力与技能时期(1958—1967年);(3)学校体育的发展体力时期(1968—1977年);(4)终身体育与快乐体育时期(1978—1988年);(5)自我教育时期(1989—1997年);(6)多元化体育课程目标时期(1998—今)。研究对各段时期课程目标的侧重点进行深入分析。     

论中国学校人文精神教育的现实意义

教育是培养人的活动.社会发展最终是以人的发展为尺度的,而人的精神生活,是人的发展的重要标志,更是当代中国教育改革的重要内容.受传统教育思想的影响,中国教育存在的主要问题在于对人的精神世界的漠视和冷淡.构建未来中国的和谐社会之根本在于教育,尤其是人文精神教育.     

浅谈中国旅游立法活动中存在的问题

本文结合中国旅游立法的现状,分析旅游立法活动中存在的问题,旨在重视旅游立法,进一步加强和完善旅游立法工作.     

罗非鱼海水养殖试验

本文报导了罗非鱼海水养殖鱼种运输、海水放养驯化等技术措施。     

我国湿地研究的现状与发展趋势

概括了近年来我国湿地的研究进展，包括湿地的定义、湿地的分类，并探讨了近年来湿地功能和效益、湿地开发利用、湿地保护以及湿地恢复和重建等四方面研究工作进展，并提出了今后湿地研究的发展方向。     

论中国历史上的"国中之国"--兼驳"台独"、"疆独"、"藏独"谬论

“国中之国”问题是关乎国家安全利益和中华民族凝聚力的一个大问题。笔通过对中国历史上曾经存在过、当今中国仍存在着的冠有“国”字称谓之政权组织的分析研究。得出迄今为止，中国历史上所有的“国中之国”都不是现代国际法语汇中的“独立国”，更不是相对中国而言的所谓“外国”。它们或为中国改朝换代时遗留的“残存国”，或为统一多民族中国缔造时期的“并立国”，或为中国巩固时期的“藩属国”，全部都是完整中国的组成部分的结论。有力批驳了“台独”、“疆独”和“藏独”谬论，阐明了台湾、新疆和西藏自古就是完整中国的组成部分的正确结论。