口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长基因组感染性克隆的构建

以构建的口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长cDNA为模板, 使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录, 得到病毒RNA. 用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞, 可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应. 对收获的病毒分别用RT-PCR, 乳鼠毒力试验以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定, 结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒. 同时用空斑实验法观察了拯救病毒及其亲本毒株的生长特性, 结果表明二者在致病性上没有明显差异, 这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础.     

深圳口岸输入寨卡病毒的基因和生物学特性分析

2016年2月14日下午,一名从斐济和萨摩亚旅游回国的旅客在深圳皇岗口岸入关时有发热症状,其在旅行期间有蚊虫叮咬史.经过病因筛查和诊断确诊为寨卡病毒感染.本研究利用乳鼠和细胞培养传代,成功从病人血清中分离到致病病原——寨卡病毒,命名为SZ_SMGC-1.分离病毒在电子显微镜下可见圆球形经典黄病毒特征,病毒颗粒直径大小约为50 nm.利用特异性引物扩增并获得了病毒全基因组序列,同源性分析显示:SZ_SMGC-1与我国输入性病例中斐济/萨摩亚来源病毒高度同源,同源性均为99.9%,与委内瑞拉来源病毒同源性在99.0%~99.4%之间.研究显示,寨卡病毒进化为亚洲和非洲2个分支.进一步遗传进化分析表明,SZ_SMGC-1毒株与近期我国分离毒株同属于亚洲分支;SZ_SMGC-1与斐济/萨摩亚来源病毒聚类在一个亚分支;委内瑞拉来源的病毒除我国首个病例处于单独的小分支外,其余病毒全部聚类到另一个小分支.生物学特性研究显示,SZ_SMGC-1寨卡病毒可以在蚊虫来源C6/36细胞和哺乳动物来源Vero,BHK-21细胞中生长,感染Vero和BHK-21细胞后可见明显病变并形成典型噬斑.值得注意的是,相同细胞系的不同细胞克隆株对寨卡病毒的敏感性不同.寨卡病毒感染敏感哺乳动物细胞系的建立,对病毒致病机制的深入研究及相关疫苗和药物的研发奠定了基础.寨卡病毒在我国的输入,给我国寨卡疫情防控带来了严峻挑战,必须提早采取灭蚊等防控措施,加紧对疫苗和相关药物的研发,做好预防寨卡流行的技术储备.     

牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性

通过同源重组将pHA2质粒插入到牛Ⅰ型疱疹病毒ZJ分离株基因组的UL15和UL18基因之间, 构建了重组病毒rBHV1-HA; 提取重组病毒的环状基因组DNA, 转化大肠杆菌DH10B, 获得了含有BHV1全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pBHV1. pBHV1转染MDBK细胞可以拯救出病毒, 该病毒与野生毒株在细胞上的繁殖特性未见差异. 通过两步Red E/T重组, 构建了gN基因跨膜区缺失的pBHV1突变体, 并转染获得了重组病毒rBHV1-?gN. 病毒繁殖动态曲线显示, rBHV1-?gN的滴度比野生毒株低9%~20%. BHV1感染性克隆的成功构建, 将为研究新型BHV-1基因缺失疫苗和牛的病毒载体疫苗提供技术平台.     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建

通过PCR方法, 删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和 ORF A2非重叠区的33 bp (96~129 bp)的同时, 引入NheⅠ酶切位点(GcTaGc)作为分子标记, 构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3, 与HZ2株B节段真核表达载体pCI-mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞. 用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞, 模拟病毒“传代”. 结果表明, 细胞的形态学特征发生变化, 产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE). 电子显微镜观察显示, 在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子. 间接免疫荧光分析结果表明, 拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达, 而非结构蛋白(VP5)则不能表达. 针对A节段的RT-PCR, 酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入. ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡, 相对HZ2株致死率(20%)明显下降. 本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统, 构建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株, 为IBDV基因组学的研究提供了新方向, 为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础.     

传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的原核表达、细胞定位及功能研究

克隆测定了传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京E3和Zhonghai毒株的糖蛋白G基因(gG)序列, 并与多种动物的Ⅰ型α-疱疹病毒gG基因序列作了比对. 通过克隆gG基因至原核表达载体pET30a(+)构建pET30a-gG质粒, IPTG诱导表达含pET30a-gG重组质粒的阳性宿主菌后, 分离纯化得到分子量约35 kD的His-GG融合蛋白. 利用该融合蛋白制备的纯化的抗His-GG大鼠多抗血清, 观测ILTV糖蛋白G的在细胞上的分布, 发现糖蛋白G主要存在于宿主细胞的细胞核外周及细胞膜上, 在散在细胞内的分布较为分散, 而在融合细胞的结合部位分布较为集中. 利用抗体中和病毒糖蛋白G的实验结果表明, 糖蛋白G可能参与病毒从细胞到细胞的直接感染(CTCS), 从而影响病毒复制和噬斑的形成.     

人胎肾和人胎肺细胞对腸道病毒的易感性的研究

虽然猴肾细胞和人羊膜细胞对现有大多数型别的肠道病毒具有普遍的易感性,但是由于猴肾细胞的来源有限和人羊膜细胞制备的成功率较低,所以需要寻求其他适合的细胞来培养这些病毒。作者在1963年较系统地研究了原代人胎肾和原代人胎肺细胞对肠道病毒的易感性,以进一步确定这两种细胞在肠道病毒工作中的使用价值。材料和方法细胞培养所用的细胞是原代人胎肾单层细胞和原代人胎肺单层细胞。生长液是0.5％乳白蛋白水解物Hanks氏溶液,合10％小牛血清。维持液是0.5％乳白蛋白水解物Hanks氏溶液,合2％小牛血清,pH为7.4。病毒株所用的病毒株包括脊髓灰质     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

转抗细胞凋亡基因p35黏虫细胞克隆株研究

通过脂质体介导的方法将抗细胞凋亡p35基因导入黏虫细胞系Ms7311, 经Zeocin抗性筛选和细胞克隆, 获得了转基因细胞株TMs7311. PCR检测证明, 转基因细胞株基因组DNA中含有p35基因特异扩增谱带. 该转基因细胞株形态与原始细胞系不同, 生长速度快, 群体倍增时间为25.4 h, 对磷酸缓冲液(PBS)有较强的营养抗性, 能抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡; 病毒产量和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)以及碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP)的表达水平明显高于原始细胞系Ms7311, 是一株高表达重组蛋白和高产杆状病毒的优良细胞株.     

基因武器

作为一种杀人不见血的新型武器,基因武器实际上是一种生物制剂。它是根据生物的遗传特性,人为地用一种"致病力强的基因"或"耐药基因"去置换另一种致病微生物(炳菌或病毒)细胞中的基     

功能化氧化石墨烯的靶向肿瘤成像与光热治疗

整合素α_vβ₃是一种跨膜糖蛋白, 高表达于多种肿瘤细胞表面, 如人恶性胶质瘤(U87-MG). 它能够作为一类肿瘤标志物, 为肿瘤类型的诊断提供依据, 并为肿瘤治疗提供潜在作用靶点. 本文以人恶性胶质瘤细胞(U87-MG)为治疗模型, 利用靶向配体——整合素α_vβ₃单克隆抗体(integrin α_vβ₃ monoclonal antibody), 偶联新型纳米材料——氧化石墨烯(nano-graphene oxide, NGO), 构建成一种新型纳米探针(NGO-mAb-FITC)用于靶向成像及光热治疗. 这种纳米探针具有主动靶向功能, 可识别α_vβ₃阳性表达细胞U87-MG, 但不被α_vβ₃阴性表达的人乳腺癌细胞(MCF-7)摄取. 通过异硫氰酸荧光素(FITC)共价修饰靶向配体, 使纳米探针(NGO-mAb-FITC)获得对肿瘤细胞的靶向成像作用. 同时, 利用氧化石墨烯在808 nm近红外激光照射下的光热转化性能, 使得特异性摄取NGO-mAb-FITC纳米探针的肿瘤细胞内部产生过高热(hyperthermia), 从而诱导肿瘤细胞热损伤及细胞凋亡. 实验结果表明, NGO-mAb-FITC能有效识别靶细胞, 为肿瘤诊断提供依据, 而利用氧化石墨烯的高光热转换性能, 为肿瘤治疗提供新途径, 并有望成为一种有潜力的新型靶向光热转换探针而用于肿瘤的成像诊断与光热治疗.     

病毒作为纳米模板的研究进展

随着基因工程和纳米技术的发展,病毒的材料学应用潜能逐渐彰显.根据材料科学的观点,病毒可被看作有机纳米颗粒,其大小、形态以及表面的功能基团的数量和性质都是经过精确定义的.由于具有合适的大小、形状和明确的化学结构,病毒可被用作材料组装的纳米量级模板,调节无机材料、金属材料、磁性材料、半导体材料等的生长和成型.本文主要以丝状结构的M13噬菌体和球状结构的豇豆花叶病毒为例,阐述病毒作为模板在纳米导线、纳米电池、晶体管、存储器电路等领域的应用进展.     

人免疫缺陷病毒(HIV)抗药性的产生机理及控制方法

近些年的临床研究表明，HIV-1会对美国FDA批准的抗HIV药物产生抗药性，影响治疗的效果。与其他病毒相比，HIV-1容易产生抗药性是由于它高速复制和RNA基因组逆转录为DNA时的易错性所致。HIV的抗药性可在体外用基因型和表现型检测法来确认。患者的药物假期往往是产生抗药毒株的直接原因。坚持用药，监测抗药毒株，多药联合治疗和不断研制新药是对付抗药性的主要手段。     

水稻“抗癌”新因子bsr-d1

稻瘟病被称为水稻"癌症",严重危害水稻的产量和品质,应用广谱持久抗稻瘟病基因是抵御稻瘟病侵害最有效的方法之一。利用全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)结合重组自交系遗传群体共相关分析,从广谱持久高抗稻瘟病水稻材料"地谷"中鉴定并获得了一个广谱抗病遗传位点bsr-d1。bsr-d1通过调控过氧化氢酶基因的表达调节H_2O_2的积累,从而影响水稻的稻瘟病抗性。bsr-d1提高稻瘟病抗性的同时,对水稻产量和品质影响不明显,因此在水稻抗病育种中具有广阔的应用前景。     

身在何处——2014年诺贝尔生理学或医学奖介绍

首先简要介绍2014年诺贝尔生理学或医学奖三位获奖者(John M. O’Keefe,Edvard I. Moser 和 May-Britt Moser)的学术生涯。然后详细介绍他们获奖的主要成就：O’keefe教授在20世纪70年代发现鼠海马上神经细胞对动物所处的位置敏感,因此命名为位置细胞;而后Moser夫妇在鼠脑的内嗅皮质中发现栅格细胞,它的感受野呈现有规律的三角形网格覆盖整个环境,从而认为这些细胞组织成动物导航系统的神经机制具有可能性。最后指出,由于脑科学研究的复杂性,这些研究工作仅是动物导航行为探究中的重大突破,离开彻底解决这个问题尚有距离。     

福辛普利钠预处理对缺血后适应大鼠心肌组织Toll样受体表达及炎症因子的影响

大鼠预先灌胃福辛普利钠, 观察其和缺血后适应(ischemic postconditioning, IPoC)对大鼠心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion, I/R)损伤后心肌组织Toll样受体(toll-like receptor, TLR)表达及心肌组织炎症浸润的影响. 将60只SD (Spragu-Dawley)大鼠随机分为假手术组、I/R组、IPoC组以及福辛普利钠+IPoC组, 每组15只. 假手术组大鼠心脏前降支下置线不结扎; I/R组予以心脏前降支结扎30 min, 再灌注1 h; IPoC组给予心脏前降支结扎30 min, 后予以3次10 s的再灌注/缺血循环, 再持续灌注1 h; 福辛普利钠+IPoC组则预先给予福辛普利钠片0.9 mg/kg, 连续灌胃14 d, 于末次灌胃2 h后, 施以IPoC组的干预过程. 所有实验大鼠腹主动脉取血并分离出心脏组织. 比色法测定血清肌钙蛋白T (cardiac troponin T, cTNT)的含量, NBT染色测定大鼠左室心肌梗死面积, 酶联免疫吸附测定法测定心肌组织单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平. 免疫组织化学方法测定心肌组织TLR2及TLR4的表达, HE染色观察心肌组织炎性细胞的浸润. 结果表明, 与I/R组比较, IPoC组大鼠心肌梗死面积明显缩小(P<0.01), 大鼠血清cTNT水平显著降低(P<0.01), 心肌组织MCP-1, TNF-α含量和炎性细胞浸润数量明显下降(P<0.05, P<0.01), 心肌组织TLR2及TLR4的表达被显著抑制(P<0.01); 与IPoC组比较, 福辛普利钠预处理可进一步降低IPoC大鼠心肌梗死面积(P<0.05), 心肌组织TNF-?水平也显著降低(P<0.01), 对心肌TLR2及TLR4的表达有进一步抑制(P<0.05). 血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利钠预处理可加强IPoC对I/R大鼠心肌的保护作用, 其机理可能与抑制TLR介导的炎症信号通路和趋化因子反应有关.     

Heterogeneous chemistry of trace atmospheric gases on atmospheric aerosols:An overview

Due to altering the budget of important trace gases and changing the composition of atmospheric aerosols,heterogeneous reactions between trace gases and liquid/solid aerosols have become an important subject of atmospheric science in recent years.However,the kinetics and mechanism of these reactions have not been well-understood yet.In recent years,we have established an integrated method to study a series of atmospheric heterogeneous reactions under control atmospheric conditions.Using on-line techniques,such as Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform spectroscopy,Raman microspectrometry and Knudsen cell,the heterogeneous reactions of a series of trace gases(NO2,SO2,H2O2,DMS,C2H5 I and Monocarboxylic acids)on mineral oxides and black carbon were investigated.The uptake coefficients and mechanisms at different atmospheric conditions(temperature,relative humidity and reactant concentration)were obtained.In addition,a home-made equipment named rotated wetted-wall reactor was designed for the in situinvestigations of the uptake of volatile organic compounds into the H2SO4 solution and H2SO4/H2O2 mixed solution.In this review,we present the main results obtained in our laboratory studies and propose some challenges that still exist in the heterogeneous reaction studies.     

Towards sustainable protection against insect-borne plant viral diseases:Phytohormones and beyond

Due to the immobility of plants,around 75% of 1100 plant virus species are piercing-sucking insect transmitted.Host plant-mediated interactions between viruses and insects play vital roles in the population dynamics of vectors and the epidemiology of plant diseases.A successful viral pathogen has to evolve multiple strategies to manipulate host immune responses and also the ecological environment to facilitate effective transmission by insect vectors.Among these strategies,reprogramming the phytohormone signaling pathways is critical to the establishment of an effective virus transmission among plants and disease pandemic.Here,we review recent studies on the plant-virus inter-relationships with a focus on molecular and biochemical mechanisms that drive vector-borne viral diseases.Defense-related phytohormones such as Jasmonic acid(JA),Salicylic acid(SA)and Ethylene(ET)have been reported to be directly regulated by viral proteins.This knowledge is essential for the further design and/or development of effective and sustainable strategies to protect viral damages so as to increase crop yield and food security.Future efforts in this area should be focused on integrating and meta-analysis of big data generating from dynamics and multiple dimensional pathogen-vector-crop interactions under real agricultural conditions to achieve sustainable protection against plant diseases.     

二甲基氯钅翁离子(CH3Cl+CH3)及其复合物的理论研究

在MP2/6-311+g^**水平上优化了(CH₃)₂Cl⁺ 的几何构型, 得到的构型参数与实验吻合得很好. 相同理论水平下对该阳离子的异构化机理进行了探讨, 该反应的决速步需翻越250.6 kJ•mol^–1的势垒, 在C—Cl键断裂及H迁移的协同作用下, 可生成质子化的氯乙烷(CH₃CH₂ClH)⁺, 如有其他阴离子存在, 可失去一个质子而转变为氯乙烷. 另外, 利用自然键轨道理论(NBO)对钅翁 离子(CH₃)₂Cl⁺和碳硼烷阴离子(CHB₁₁Cl₁₁)^—相互作用的本质进行了详细探讨, 阴阳离子之间的二级稳定化能表明, 阴离子上的Cl原子孤对电子与钅翁 离子上C—H反键相互作用较大, 拉长了钅翁 离子上非平面的C—H键. 阴阳离子的静电势图进一步证实负静电势主要分布在氯代碳硼烷上, 正电势主要分布在二甲基氯钅翁 离子上. 在B3LYP/6-31G的水平上计算了甲基正离子在钅翁 离子和碳硼烷阴离子上的迁移机理, 迁移过程只需克服11.3 kJ•mol^–1能垒即可, 说明当碳硼烷阴离子存在时, 二甲基氯钅翁 离子不可能发生异构化反应得到氯乙烷, 只能产生氯仿.