固定化青霉素G酰化酶活性的X射线微区分析(Ⅰ)———捕捉剂的选择

为了能对固定化青霉素G酰化酶进行X射线微区分析 ,筛选了能捕捉酶活的合适的底物与捕捉剂的体系 ,青霉素G钠作为底物 ,FeCl3 作为捕捉剂 ,底物经固定化青霉素G酰化酶水解产生苯乙酸 ,后者与捕捉剂反应生成沉淀 ,可以确定固定化青霉素G酰化酶的催化活性部位 ;还对捕捉剂与底物、固定化青霉素G酰化酶与载体以及载体与底物之间的相互作用进行了研究 ,找到了可用于对固定化青霉素G酰化酶活性进行X射线微区定位的捕捉剂.     

固定化青霉素G酰化酶活性的X射线微分析(Ⅱ)—活性定位

利用苯乙酸与捕捉剂反应生成的沉淀 ,确定固定化青霉素G酰化酶的催化活性部位 .对不同酶活的固定化青霉素G酰化酶进行了活性定位的研究 ,发现酶活的部位集中分布在载体的表面上 ,且分布不均匀 ,而断面上几乎没有酶活存在 ,证明了该方法的可靠性与准确性     

固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶通过共价结合在环氧型载体EupergitC上,通过对酶质量浓度、固定化反应时间、pH 值以及反应温度等条件的考察,确定了最优固定化条件：375mg比活力5000U/g的重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶蛋白对应1g载体,最适pH8.0,反应温度30 ℃.反应120h后制得固定化青霉素G酰化酶活力达到220U/g,固定化酶效率为10.7%.该固定化酶可在含饱和乙酸丁酯磷酸缓冲液中彻底水解青霉素G钾盐.经过15批连续水解反应,固定化酶仍保持95%的活力,展现出良好的稳定性.     

青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

Co（Ⅱ）对青霉素酰化酶的激活作用

文中报道Ｃｏ（Ⅱ）对巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶的激活作用。并用荧光光谱法对其可能的机理进行了研究。结果表明：Ｃｏ（Ⅱ）对青霉素酰化酶具有荧光猝来作用，但并没有引起整个酶分子空间构象的变化，而是与活性部位的某些基团发生了络合作用，有利于底物的诱导契合从而引起酶活力的提高。     

巨大芽孢杆菌产青霉素酰化酶发酵条件的研究

该文对一株巨大芽孢杆菌产胞外青霉素酰化酶的发酵条件下进行了初步研究。不同的氮源及装液量和发酵时间产酶均有影响。该菌株在２７－２８℃１８０ｒ／ｍｉｎ，初始ＰＨ８．０，苯乙酸浓度０．６％的最佳发酵条件下发酵６０ｈ左右，青霉素酰化酶活力可达５００－７００Ｕ／１００ｍｌ。     

粪产碱杆菌青霉素酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达优化

在5L发酵罐中进行了表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的重组枯草杆菌WB600(pMA5)的发酵研究。实验表明，发酵液中的葡萄糖浓度和菌体产酶能力密切相关，维持低葡萄糖水平，可以提高枯草杆菌WB600(pMA5)青霉素G酰化酶的合成能力。采用混合碳源进行发酵，在生长阶段流加葡萄糖，并维持低浓度，在发酵12h菌体浓度达到约13．8g／L时停止流加葡萄糖，使茵体利用发酵液中的可溶性淀粉作为碳源，避免葡萄糖的代谢副产物对茵体产酶能力的抑制，青霉素G酰化酶的表达水平从原来的55u／L提高到582u／L。     

青霉素酰化酶研究——Ⅱ.酶的修饰和修饰酶的性质

本文介绍用β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)活化右旋糖酐T2000以修饰大肠杆菌5852青霉素酰化酶。活化时500mg右旋糖酐需SESA 20mg。制备对氨基苯磺酰乙基葡聚糖(ABSE)-右旋糖酐的反应温度为80℃,与500mg活化右旋糖酐偶联的酰化酶酶量为100u,修饰率达88.3%。用琼脂糖(Sepharose 4B)或交联葡聚糖(Sephadex G150)柱层析分离得高分子量的修饰酶。修饰酶对热和pH的稳定性均优于自由酶,最适温度提高,但最适pH和高浓度青霉素G底物抑制现象没有改变。     

用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶

采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶 ,粗酶液比活达8.20×10-8 mol/(s·mg) ,比超声波法高10倍以上 ,酶活总收率达93.3 %。     

PGA在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰

研究了青霉素G酰化酶(PGA)在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰,优化固定化条件为1 mol/L,pH 8.0的磷酸钾缓冲体系,每克载体(湿重)投酶量为500~550 U,30℃下150 r/min固定化36~48 h,得到的固定化酶表观酶活为每克载体(湿重)177 U,表观酶活回收率35%。固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了热稳定性。固定化酶水解青霉素G的最适pH为9.0,最适温度为47℃,在pH 4~9,40℃以下稳定。固定化酶的各项性能均优于游离酶。     

分子伴侣GroEL对青霉素G酰化酶亚基折叠的影响

采用Tac启动子控制表达质粒，在不同的宿主细胞中表达了青霉素G酰化酶（PAC），检测这些菌株所表达的PAC活性，分析细胞内分子伴侣GroEL含量，PAC翻译后加工为α，β亚基的状况，以及它们之间的关系，结果表明：质粒pKK-SP在不同宿主中表达时，翻译后加工状况有明显差异，单位质量细胞所表达的PAC活性与翻译后加工效率相关，且与细胞内分子伴侣GroEL在菌体总蛋白中含量正相关，同时也阐明了亚基的折叠成为翻译后加工过程的限制步骤，细胞内分子伴侣GroEL有助于PAC亚基的折叠和稳定。     

Co-MCM-48和Co-MCM-41介孔分子筛对青霉素酰化酶的固定化作用

制备了含钴MCM-48和MCM-41的介孔分子筛,用作酶生物催化剂固定化的载体．采用XRD、低温N2吸附及FT-IR等方法研究了介孔载体的结构特征、表面酸性和对青霉素酰化酶（Penicillin G Acylase,PGA）的固定化作用．结果表明,Co-MCM-48与Co-MCM-41介孔分子筛表面存在着弱酸性高浓度的自由羟基,为酶的固定化提供了功能性基团和适宜的微环境．固定化酶PGA／Co-MCM-48水解青霉素G的表现活性为1682IU／g,约是PGA／Co-MCM-41水解青霉素G表现活性的2．4倍．经6次连续操作使用,PGA／Co-MCM-48的水解活性降至1375IU／g,保持其初始活性的81％,而PGA／Co-MCM-41保持其初始活性的42％．Co-MCM-48固定化青霉素酰化酶的活性和操作稳定性显著好于Co-MCM-41固定化酶。     

Rapid Cloning and Expression of Glutaryl-7-Aminocephalosporanic Acid Acylase Genes from Soil Samples

A polymerase chain reaction （PCR）-based strategy was developed to rapidly obtain the gene encoding for an industrially important enzyme, glutaryl-7-aminocephalosporanic acid （GL-7-ACA） acylase.Different soil samples were cultured with a Pseudomonas selective medium to enrich specific microorganisms, and then the genomic DNA was extracted to serve as PCR templates. PCR primers for GL-7-ACA acylase gene amplification were designed on the basis of bioinformatics searches and analyses.The method was used to successfully amplify three GL-7-ACA acylase genes from different soil samples.The GL-7-ACA acylase genes were then cloned and overexpressed in Escherichia coil with a relatively high level of 266 unit · L^-1.     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

功能基化聚丙烯酸甲酯固定青霉素G酰化酶的性质

采用肽键法将青霉素G酰化酶固定在功能化的聚丙烯酸甲酯上得固定化酶 ,其最适pH为8.2,最适反应温度为70℃ ,该固定化酶在pH6～10和40℃以下非常稳定 ,表观米氏常数为1.48×10-2mol/L,最大反应速度为5.09mmol/s.33℃下水解质量分数为5 %的青霉素G,使用63次,酶活力保留79.4 %.在4℃的湿润状态下贮藏25d,酶活力保留97.6 %.     

Characterization of cellulose acetate micropore membrane immobilized acylase I

This paper describes an innovative method for the immobilization of acylase I, which was entrapped into the CA-CTA micropore membrane. The most suitable casting solutions proportion for immobilizing the enzyme was obtained through orthogonal experiment. Properties of the enzyme membrane were investigated and compared with those of free enzyme and blank membrane. The thermal stability and pH stability of the enzyme inside the membrane were changed by immobilization. The optimum pH was found to be 6.0, which changes 1.0 unit compared with that of free acylase I. The optimum temperature was found to be about 90℃, which is higher than that of free acylase I (60℃). Experimental results showed that immobilization had effects on the kinetic parameters of acylase I.     

青霉素酰化酶工程菌的褐藻胶固定化

本文报告以褐藻胶(海藻酸钠)固定化青霉素酰化酶工程菌的方法。本方法对大肠杆菌的包埋量可达30～40％(W/W),酶活回收率为88％。本文对6-APA测定的PDAB法进行了改进;对固定化细胞酶活的测定提出一种新方法。     

青霉素G酰化酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质

利用凝胶-溶胶方法对磁性Fe3O4微粒表面进行功能化修饰,制备了表面含氨丙基的磁性复合载体,并通过戊二醛交联制备固定化青霉素G酰化酶(PGA).结果表明,在37℃时,固定化酶水解青霉素G钾盐,制备6-氨基青霉烷酸的表观活性为1 886 IU/g,表观米氏常数K'm＝140 mmol/L,最大反应速度Vmax＝0.45 ...