一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

基于CRISPR/Cas9技术构建TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结直肠腺癌细胞Caco-2中的辣椒素受体基因TRPV1,构建TRPV1基因敲除的Caco-2稳定细胞系.使用CRISPR/Cas9在线靶点设计程序在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中设计一对gRNA,将gRNA构建到真核重组表达质粒的载体上,电转染待敲除细胞,经嘌呤毒素抗性筛选和基因测序获得敲除TRPV1基因的稳定细胞系.用Western Blot检测TRPV1基因蛋白表达量验证Caco-2中TRPV1基因的敲除效果,CCK-8检测TRPV1基因敲除细胞的生长曲线,与野生型细胞对比检测TRPV1基因敲除对细胞生长的影响.筛选出TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,而且TRPV1基因敲除对Caco-2细胞生长无显著影响.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,为后续研究辣椒素对肠道脂类吸收影响的机理研究提供了有利的工具.     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼核受体PXR基因初探

孕烷X受体(Pregnane X receptor,PXR)是核受体超家族(NRs)中NR1I的重要成员之一,在保护机体免于内源性和外源性物质损伤方面具有重要作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立PXR基因敲除的斑马鱼模型,为研究环境污染物的毒性机理及代谢过程提供基础模型。根据PXR基因序列,设计gRNA靶位点,体外转录合成gRNA。同时,将设计合成的gRNA与Cas9 mRNA通过显微注射转入斑马鱼受精卵,经孵化、筛选出有效的突变体,并逐代培养杂交筛选出PXR基因敲除突变体。结果表明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除PXR基因,经测序分析获得稳定的PXR(+4/+4)基因纯合体。     

水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.     

CRISPR/dCas9在细菌转录调控中的应用及展望

CRISPR/dCas9是以CRISPR/Cas9系统为基础发展而来的转录调控工具.本文综述了CRISPR/dCas9作为转录抑制工具(CRISPRi)和转录激活工具(CRISPRa)的发展及应用,总结了在细菌中应用CRISPR/dCas9系统时转录调控系统的选择、构建、靶位点的选择以及gRNA的设计等方面存在的问题,并对相关解决方法进行了展望.     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

利用epiCRISPR载体表达双sgRNA实现高效的HDAC基因编辑

CRISPR/Cas9技术是广泛使用的一种基因编辑技术,它包括Cas9和gRNA 2个元件.具有内切酶活性的Cas9能够通过gRNA识别并切断目标DNA序列.细胞主要通过非同源末端连接途径修复DNA,这是一个容易产生indel的修复途径,理论上有近2/3概率产生移码突变,可以用于基因敲除.很多癌细胞系和体外培养的细胞系基因拷贝数增加了,同时敲除所有拷贝的难度增大,因此有必要开发一种高效的基因敲除方法.本实验室在前期工作中利用附着体载体表达的Cas9和gRNA,可以高效地产生indel,称为epiCRISPR系统.在本研究中,我们用epiCRISPR系统同时表达2个gRNA,可以在目标基因上删除一段DNA序列,其长度不是3的倍数,这样可以高效地产生移码突变.HDAC(histone deacetylase)基因家族编码一类负责组蛋白去乙酰化的蛋白酶,对细胞生长有重要影响,敲除难度较大.我们利用附着体载体表达双gRNA的技术成功地得到了HDAC1、HDAC2和HDAC6纯合敲除细胞系.     

CRISPR/Cas9基因组编辑新进展

正2016年4月份,美国农业部(USDA)在一封公开函中声明,他们不会对利用CRISPR/Cas9技术得到的基因编辑蘑菇进行监管。这意味着这种蘑菇可以不通过相关机构的监管程序就可以栽培并销售。这是第一种得到美国政府绿灯通行的利用CRISPR/Cas9技术得到的有机体,也是过去5年中不受USDA监管的30种基因改造有机体之一。这30种有机体大多数是植物,其中几种是通过ZFN和TALEN基因编辑技术得到的,而使用CRISPR/Cas9技术得到的作物终于也得到了同样的通行政策。该项目的参与者、中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞说:"我有信心看到将有更多的基因编辑作物不受管理部门的监管。"     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

CRISPR/Cas9技术联合AAV对Rosa-mTmG小鼠的MEF细胞进行编辑

目前,基因编辑技术已被广泛用于生物医学研究,本研究利用AAV(Adeno-Associated Virus)递送CRISPR/Cas9系统,实现高效率的基因编辑,并对特定组织细胞中的基因编辑进行了初步探索.我们首先采用Rosa-mTmG转基因小鼠来研究CRISPR/Cas9在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)中的编辑效率;接着,我们构建了能够被AAV包装的SaCas9系统,并通过瞬转以及AAV介导递送的方式检测其基因编辑效率;最后,我们还构建了含有心肌特异启动子的cTNT-PX601-sgRNA以备后续研究.结果发现,与瞬转相比,AAV介导CMV-PX601-sgRNA在体外能够极大地提高细胞的基因编辑效率.另外,cTNT-PX601-sgRNA能够在心肌细胞中特异表达.我们的结果表明,利用AAV介导的CRISPR/Cas9系统在体外可以实现高效地基因编辑,为靶向修复基因缺陷疾病,特别是特定组织器官中的基因缺陷,提供了研究工具和实验依据.     

张锋团队发布CRISPR全新诊断系统

<正>美国博德研究所张锋团队在近日出版的《科学》杂志上发表论文称,他们用另一种剪切酶Cas13a取代CRISPR/Cas9中的Cas9,将原本靶向DNA(脱氧核糖核酸)的基因编辑工具延伸为靶向RNA(核糖核酸)的全新诊断系统,灵敏度甚至高到能检测出单个目标核酸分子,有望给基础研究、传染病诊断治疗等带来革命性影响。2016年6月,张锋和同事首次发表论文称,CRISPR/Cas13a能精确剪切细菌细胞中的特定RNA序列。但与Cas9     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9"基因剪刀"而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.