利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养，并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系，细胞出现了明显的细胞病变（Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体，胞质中散在6角形、5角形或圆形的病毒粒子，大小为100－140nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。     

利用经修饰的survivin短肽体外诱导对胃癌细胞系具有限制性杀伤作用的特异性细胞毒性T细胞

采用一种简单有效的方法体外诱导经修饰的survivin短肽特异性细胞毒性T细胞,并观察其对胃癌细胞的杀伤作用。选取对HLA-A2分子亲和力更高的survivin短肽(96—104,LLLGEFLKL,HLA-A2限制性)以更有效地诱导特异性T细胞。选取正常志愿者外周血单核细胞,筛选其中HLA-A2+者,利用HLA-A2/survivin短肽有效诱导特异性细胞毒性T细胞。Pentamer实验检测特异性细胞毒性T细胞比率。Elispot实验检测细胞毒性T细胞IFN-γ分泌能力。选取胃癌细胞系MKN28、SGC7901及KATO Ⅲ,检测其HLA-A2和survivin表达情况。检测特异性细胞毒性T细胞对三种细胞系的杀伤效果。Pentamer实验结果显示,HLA-A2/survivin短肽刺激之前短肽/HLA Pentamer和CD8双阳性细胞仅为0.06%,接受刺激后双阳性细胞增加到27.5%。Elispot实验结果显示HLA-A2/survivin短肽刺激后IFN-γ分泌细胞比率明显强于阴性对照组。PCR结果显示,KATO Ⅲ为HLA-A2+,MKN28和SGC7901为HLA-A2-。Western Blotting结果显示KATO III和SGC7901为survivin阳性,MKN28为survivin阴性。特异性细胞毒性T细胞杀伤结果显示,细胞能有效杀伤KATO III细胞,但对其他两种细胞杀伤效果不明显。p<0.01。经修饰的survivin短肽能够有效诱导特异性细胞毒性T细胞,并对胃癌细胞系有HLA-A2/survivin限制性杀伤。     

氰戊菊酯对Tn细胞系P450及蛋白质谱表达的影响

研究氰戊菊酯对粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni, Tn)细胞系细胞色素P450(P450s)的诱导作用及蛋白质谱表达的影响.用MTT法和台盼兰法观察不同浓度氰戊菊酯处理Tn细胞12 h后细胞的存活率;光谱测定法测定P450s含量;以12.5 μmol/L氰戊菊酯处理Tn细胞12 h,通过二维液相色谱分离技术分析处理前后Tn细胞系蛋白质谱的变化.结果显示：当氰戊菊酯处理浓度高于17.5 μmol/L时,Tn细胞形态发生明显变化,且细胞死亡率显著高于对照组(P<0.01).P450s的含量有随氰戊菊酯浓度增加而升高的趋势,并在氰戊菊酯浓度为12.5 μmol/L时达到最高(8.562 nmol/mg protein);P450s的含量亦有随处理时间延长而升高的趋势,且在12 h时达到最高(5.28±1.14 nmol/mg protein).通过二维液相色谱分离技术得到124个差异组分,其中42个组分上调,82个组分下调.结果表明：氰戊菊酯对P450s确有诱导作用,且氰戊菊酯诱导前后Tn细胞中蛋白的变化可能与P450s诱导途径中某些受体的变化有关.     

氰戊菊酯对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

通过加入PD98059(细胞外信号调节激酶阻断剂)后探讨氰戊菊酯诱导乳腺癌细胞增殖的作用机制.观察加入PD98059前后氰戊菊酯诱导的细胞增殖情况,采用MTT法,流式细胞仪测定周期法,流式细胞仪法观察ERα蛋白、ERK蛋白和p-ERK1/2蛋白表达情况.氰戊菊酯能够明显升高MCF-7细胞的S期细胞数,作用程度与雌二醇相似,并且通过降低ERα蛋白表达量,升高p-ERK蛋白表达量促进MCF-7细胞的增殖;加入PD98059后,S期细胞比例降低,ERα蛋白表达量升高,p-ERK蛋白表达量降低,MCF-7细胞的增殖降低.氰戊菊酯通过ERK细胞信号转导通路发挥促细胞增殖作用.     

鳜细菌性烂鳃病的组织及细胞超微结构观察

从亚显微结构观察患有由柱状屈桡杆菌引起的鳜烂鳃病的鳃、肝、肾组织和细胞的病变情况,结果表明：鳃、肝、肾组织和细胞均发生严重病变,其中鳃组织细胞发生大面积坏死;肝、肾病变相对较轻,存在不同程度的病变,细胞从肿胀,变性及坏死解体,坏死的细胞少见。     

氯化镉对条斑星鲽卵巢细胞的毒性作用及其机理研究

使用不同浓度的氯化镉（CdCl2）处理体外培养的条斑星鲽卵巢（BFO）细胞系细胞,利用毒理学和细胞生物学方法研究了重金属镉对BFO细胞的细胞毒性及其作用机理。毒性作用研究结果显示,BFO细胞对CdCl2敏感,浓度大于10ixmol／L的CdCl2对细胞的生长具有显著的抑制作用,能引起细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GST—Px）活性的持续降低和丙二醛（MDA）含量的持续升高,且具有浓度依赖性;机理研究结果显示．浓度大于40μmol／L的CdCl2可引起BFO细胞出现典型的凋亡细胞形态,BFO细胞在AO／EB荧光双染色中的质膜通透性显著提高,在单细胞凝胶电泳中出现明显的彗尾,且细胞凋亡率、彗尾的长度和亮度随CdCl2浓度的增加而逐渐升高,并具有浓度依赖性。可见,镉对BFO细胞具有显著的毒性作用,其毒性作用是通过诱导细胞凋亡来实现的,为利用BFO细胞系研究镉等重金属的细胞毒性及其作用机理奠定了基础。     

ConA或PHA对鮎(Silurus asotus)皮肤和鳃粘液细胞密度的影响

用阿利新蓝-过碘酸雪夫氏试剂染色法(AB-PAS),对鲇(Silurus asotus)皮肤和鳃粘液细胞进行分类,研究ConA或PHA浸泡和注射刺激对鲇皮肤和鳃粘液细胞密度变化的影响.结果表明:(1)除鳃丝软骨Ⅴ型粘液细胞密度经浸泡刺激无显著增加外,无论采取ConA或PHA浸泡刺激还是注射刺激,皮肤中的Ⅰ型,Ⅳ型粘液细胞和鳃中的Ⅱ型和Ⅲ型粘液细胞密度都有显著增加.(2)经ConA注射或浸泡刺激后,皮肤中粘液细胞密度分别增加了64.2%和145%,鳃丝中粘液细胞密度分别提高了173%和220%;经PHA注射或浸泡刺激后,皮肤粘液细胞密度分别增加了67.8%和142%,鳃丝粘液细胞密度分别增加了108%和196%;经ConA或者PHA注射刺激,鳃丝软骨的粘液细胞密度都有显著增加,分别增加了68.8%和13.2%,浸泡刺激对粘液细胞密度都没有显著影响(3)ConA刺激较PHA刺激效果明显,浸泡刺激较注射刺激效果明显.     

纳米氧化硅的体外细胞毒性

采用红细胞溶血实验、MTT法、形态学和测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量比较纳米S iOx及微米S iO2对红细胞和RAW264.7细胞的毒性作用;测定丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(.OH)、超氧阴离子自由基(O2.-)、一氧化氮(NO)等氧化应激指标,探讨其毒作用机制.研究结果表明:纳米S iOx与微米S iO2在一定粒子浓度范围内致红细胞溶血率及生成MDA的量随浓度增加逐渐升高,呈剂量-反应关系;RAW264.7细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为11.60,38.12mg/cm2;染毒细胞体积明显增大,呈气球样变;纳米S iOx及微米S iO2在0.036~0.571mg/cm2浓度范围内,可引起培养液中LDH活性显著升高,呈时间-效应关系,相同浓度纳米S iOx致培养液中LDH含量高于微米S iO2;染毒细胞内MDA,H2O2,.OH,O2.-,NO水平显著升高.结果提示相同浓度纳米S iOx的毒性作用较微米S iO2强,氧化应激在细胞毒性中起一定作用.     

猪树突状细胞的体外扩增

树突状细胞(DC)是一类专职的抗原提呈细胞,在激发机体初始免疫反应和调节T细胞介导的免疫反应中都发挥十分重要的作用,但至今对猪DC的了解较少.本研究从猪外周血中分离获得单核细胞,分别加入150ng/mLpGM-CSF和100U/mL pIL-4,体外培养6 d后诱导出大量DC,通过显微镜观察可见其细胞表面具有典型的树突状突起,呈毛刺状.猪DC的体外获得将为进一步研究许多病毒性疾病的致病机理奠定坚实的基础.     

微波和长春新碱和对白血病细胞的体外净化研究

旨在研究一种较好的微波和长春新碱的联合方法,用于白血病细胞的体外净化。将微波和长春新碱分别单独以及联合作用正常骨髓细胞ＨＬ６０、Ｕ９３７和Ｋ５６２细胞株,通过ＧＭ－ＣＦＵ和ｔＣＦＵ的测定来评价体外净化的效果。结果发现微波和长春新碱以ＧＭ－ＣＦＵ、ｔＣＦＵ存活率均表现出抑制作用,抑制程度呈现出功率相关性和浓度相关性;在一定范围内,微波和长春新碱对３种细胞株ｔＣＦＵ存活率的抑制显著大于ＧＭ－ＣＦＵ（Ｐ     

牙鲆"体表出血病"病原的研究

对患"体表出血病"的牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝、肾、肠等组织进行病原菌分离、培养纯化、人工感染、菌种生理生化试验和药敏试验等研究,得知引起该病的病原有3种菌.根据形态及生理生化特征,确定这3种菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolaticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和类产碱假单胞菌(Pseudomas pseudoalcaligenes).     

盐度对星斑川鲽幼鱼鳃和肾细胞结构的影响

在实验室塑料水槽中,观察了盐度为0、8、16、24、32时星斑川鲽幼鱼(10.6±0.27 g)生长状况,并且利用显微镜和透射电镜研究了不同盐度驯化下星斑川鲽幼鱼鳃泌氯细胞和肾近曲小管上皮细胞的分布结构特征.在海水中,鳃丝和鳃小片上泌氯细胞数量多.超微结构显示,细胞内线粒体数量大,顶隐窝较深;随着渗透压的降低,向低盐过渡过程中星斑川鲽幼鱼鳃中的泌氯细胞个数变少,多见于鳃小片基部,细胞核大且明显,线粒体少,细胞表面顶隐窝变浅.在海水中,肾小球和肾小管出现不同程度的萎缩,近曲小管上皮细胞中线粒体数量少,刷状缘退化.随着渗透压的降低,向低盐过渡过程中星斑川鲽幼鱼肾小球充盈,肾小管发达,近曲小管上皮细胞中线粒体数量增多,刷状缘发达.     

Ultrastructural Observation of the Skin Chloride Cells of Japanese Flounder Paralichthys olivaceus and Turbot Scophthamus maximus Larvae

The ultrastructures of skin chloride cells in cultured Japanese flounder and turbot larvae in metamorphosis,which grow in the same feeding conditions,are examined with a transmission electron microscope.These developed skin chloride cells were shaped like flattened ellipsoids and similar in morphology and ultrastructure to typical chloride cells of euryhaline fish gill.They locate in the epidermis and contract with the extra and interior environment through the apical pit and narrow channels.The cytoplasm of cell is full of numerous mitochondria and a ramifying network of tubules.The degeneration of skin chloride cells is observed with development of Japanese flounder larvae.Skin chloride cells of turbot are less developmental than those of Japanese flounder in the same developmental stage.     

耐温牙鲆分子标记辅助选育研究

应用分子标记进行耐温牙鲆的辅助选育.首先应用已知的与耐温性为极显著负相关的牙鲆微卫星引物Po42对50尾牙鲆亲鱼DNA进行PCR分析,根据PCR分析结果将其分成耐温组和非耐温组.经过人工催产,耐温组的产卵量明显大于非耐温组和对照组.耐温组繁育的子代仔鱼变态率明显比非耐温组和对照组子代高.在人工增温的条件下,耐温组仔鱼成活率比非耐温组和对照组的仔鱼显著提高.本研究结果证明,牙鲆微卫星引物Po42可用于耐温牙鲆的分子标记辅助选育,同时也进一步确认其与牙鲆耐温性状具有关联性.     

Occurrence, Development and Histochemical Characteristics of Lymphocystis in Cultured Japanese Flounder （Paralichthys olivaceus）

Occurrence and development of lymphocystis cells in flounder Paralichthys olivaceus, and some his-tochemical features are studied using light and electron microscopy and histochemical methods. Fibrob-lasts engulf virus particles forming phagocytosis vacuole in the cytoplasm. The infected cells proliferate and turn round and hypertrophied; basophilic inclusion bodies, Feulgen-positive, are present in the cyto-plasm, and a hyaline capsule, containing acid ploysaccharide and protein, appears outside cell mem-brane. The mature lymphocystis cells possess numerous virus particles (200～220nm in diameter with a central core 120～140nm) and high electron-dense inclusions with budding virious at the surface in the cytoplasm, and show margination of chromatin. Moderate electron density particles (70～80nm in diame-ter) fill out perinuclear cistema and arrange in crystalloid arrays in nucleus, liberated into the cytoplasm by rupture of nuclear membrane. No virus particles are observed in nucleus. Therefore, inclusion bodies are the sites of virus assembly and maturity, while replication processes of lymphocystis virus are involved in both nuclear and cytoplasmic phases. Besides, strongly basophilic link-like structures are present be-tween adjacent cells or through connective tissue, and virus particles are observed in somewhere of the capsule, thus where may be the spread route of virus from one cell to another or to the environment. The senile lymphocystis cells release virus bv the runture of cells.     

不同能量蛋白比饲料对牙鲆体内消化酶活性的影响

采用9种不同能量蛋白比的饲料投喂牙鲆鱼苗,分析比较不同营养水平的饲料对牙鲆体内消化酶活性的影响．结果表明：随着饲料中能量蛋白比的增加,牙鲆胃肠道脂肪酶活性呈现出增强的趋势．在饲料中同一淀粉水平下,不同能量蛋白比的变化,未引起肠道淀粉酶活性呈现规律性变化．在饲料中同一蛋白水平下,能量蛋白比的变化,并未引起肠蛋白酶活性呈现规律性的变化,但是对饲料中蛋白水平在46％～52％,胃蛋白酶活性有随着能量蛋白比的升高而增强的趋势,牙鲆幼鱼饲料以蛋白水平在46％、能量蛋白比在31.72～36．81 kJ／g范围内,胃、肠道的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性较强．     

牙鲆家系的建立及早期生长比较

以东海舟山海域野生牙鲆群体为亲本,采用人工授精技术,共构建14个牙鲆家系,分别测定了各家系120日龄30个个体的全长、体长和体重,对家系间的生长和家系内的个体体重变异进行了比较。结果表明:不同家系间的全长、体长和体重的差异均极显著(P<0.01)。家系1、3、4、10、11和14为生长较快家系,按体重大小依次排列为3>10>11>1>14>4,按全长长短依次顺序为3>14>1>4>11>10。家系2内个体体重变异最大。家系3个体体重变异小,其体重平均值要高出体重最小家系35%,表现出明显的生长优势。这一研究为进一步通过家系选育方法培育适合浙江沿岸生长的优良品系奠定基础。     

IL-2联合银耳多糖激活的脾细胞对体外肿瘤细胞杀伤作用的研究

目的研究淋巴因子IL-2联合银耳多糖(Tremella Polysaccharide TP)共同激活的小鼠脾细胞对肿瘤细胞的体外杀伤作用.方法用甲基-3氢胸腺嘧啶核苷标记肿瘤细胞H22,B16,p815,将标记的靶细胞悬液调至1×105/mL,分别以效靶比40∶1,20∶1和10∶1加入效应细胞,混匀后置37℃5%CO2培养箱内培养2h,2h后用γ-闪烁记数仪对上述细胞悬液进行检测.结果 2种效应细胞对B16杀伤作用最强,H22次之,p815最弱,TP-LAK细胞的作用较之LAK细胞更强(P<0.05),且效靶比越高,杀伤作用越强.结论 IL-2激活脾LAK细胞是有效的抗肿瘤细胞,IL-2与银耳多糖在活化脾细胞提高抗肿瘤方面具有协同作用.     

In Vitro Cytotoxicity and Protein Drug Release Properties of Chitosan/Heparin Microspheres

Chitosan/heparin microspheres were prepared using the water-in-oil emulsification solvent evapo- ration technique. The microsphere diameters were controlled by selecting the fabrication process parame- ters. Scanning electron micrographs showed that the chitosan/heparin microspheres were regular and the surface morphology was smooth. Fourier transform infrared showed that the chitosan amino groups reacted with heparin carboxylic groups to form acylamides in the microspheres. Analysis of the microsphere cytotox- icity showed that they had no cytotoxic effect and behaved very similar to the negative control (polystyrene). To analyze the protein drug release profiles of the microspheres, bovine serum albumin was loaded as a model drug into the microspheres and released in vitro. Marked retardation was observed in the BSA re- lease profiles. The results show that chitosan/heparin microspheres may provide a useful controlled release protein drug system for used in pharmaceutics.