通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶. 采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321, 通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达. 抗盐抗旱检测结果表明, 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸, 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5~15倍; 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快, 苗与根的生物学产量都要高于对照, 最后种子产量也显著高于对照, 如在0.1 mol/L NaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%~41%, 说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用, 通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

利用反射差频参量阵进行生物组织B/A值的层析成像

在有限振幅插入取代法的基础上, 提出了利用反射模式的差频参量阵对生物组织的非线性声参量B/A值进行层析成像的理论和实验方法; 测量了差频声波的指向性, 并对若干生物样品进行了实验成像, 获得了满意的结果, 为医学超声提供了一个新的成像方法.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

异源nifA基因对苜蓿中华根瘤菌nifA突变体的互补分析

为深入研究苜蓿中华根瘤菌NifA的特性, 分别用组成型表达的慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的nifA 基因互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体, 观察其共生表型. 结果表明, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌nifA 基因不能互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体的共生表型. 以苜蓿中华根瘤菌 nifA 突变体为遗传背景, 利用全基因组微阵列实验比较分析引入异源nifA 基因后产生的基因表达谱的变化. 结果显示, 苜蓿中华根瘤菌自身NifA蛋白引起238个基因的表达发生变化. 这些表达差异的基因分属共生、能量和中心代谢、持家、细胞结构与运输等生物学功能组. 慢生型大豆根瘤菌、紫云英根瘤菌和阴沟肠杆菌的NifA蛋白分别引起了20, 7和9个基因的表达发生变化. 这些基因主要是固氮相关基因, 但差异不及苜蓿中华根瘤菌NifA互补菌明显. 以苜蓿中华根瘤菌nifH启动子与lacZ融合基因为报道基因, 研究nifH的表达. 结果指出, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的NifA蛋白只能部分激活苜蓿中华根瘤菌nifH的表达, 激活水平分别为苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白激活率的70%和50%, 与微阵列实验结果相符.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

大豆GmNHX1在百脉根中的过表达研究: 体内Na+含量的降低是耐盐性提高的基础

从大豆中克隆到了液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白编码基因(GmNHX1)的全长cDNA, 包括5′端非翻译区464 bp, 编码区1641 bp, 3′端非翻译区486 bp, 共2591 bp. 该cDNA编码的GmNHX1蛋白共546个氨基酸, 具有典型的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白特征, 与已知功能的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白AtNHX1, OsNHX1及AgNHX1具有较高的同源性. GmNHX1在大豆基因组中为单拷贝基因, 其表达具有组织特异性, 并能受到NaCl, KCl, LiCl, ABA以及脱水等胁迫上调; 耐盐品种GmNHX1的转录水平在叶片中低于而在根系和下胚轴中均高于敏盐品种. 将GmNHX1 cDNA置于两个串联的CaMV35S启动子控制下在豆科模式植物百脉根中过表达, 提高了转基因百脉根的耐盐性. Na⁺及K⁺含量测定表明, 与对照相比, 过表达GmNHX1的百脉根小苗中Na⁺, K⁺含量显著降低, K⁺/Na⁺比率显著增加, 显示了百脉根中过表达GmNHX1所导致的耐盐性与减少转基因植物中Na⁺的积累有密切关系.     

转OsNHX1基因耐盐84K杨的培育

采用农杆菌介导的方法将水稻Na+/H+反向转运器基因OsNHX1导入84K杨, 获得3株抗性转化植株, PCR, Southern 和Northern检测结果表明, OsNHX1基因已经整合到84K杨基因组中, 并可以稳定表达. 耐盐实验表明, 3个株系的转基因植株能在200 mmol/L NaCl条件下正常生长. 对盐胁迫处理的转基因植株进行Na+含量和渗透势测定, 发现转基因植株叶片中的Na+明显高于对照植株, 其渗透势明显低于对照植株. 分子检测和耐盐性实验表明OsNHX1基因的转化获得成功, 并获得84K杨耐盐转基因 植株.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节

EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1 (LMP1)是重要的致瘤蛋白, 可活化包括AP-1在内的多个转录因子. 转录因子功能性活化体现在其与靶基因启动子结合, 反式激活靶基因转录, 调节靶基因的表达, 从而发挥其生物学效应. 最近发现LMP1可介导c-Jun/Jun B活性异源二聚体的形成, 为寻找其靶基因提供了重要的依据. 采用生物信息学技术, 确定了c-Jun/Jun B活性异源二聚体调控的潜在靶基因p16; 在此基础上, 利用建立的Tet-on系统调控LMP1表达的细胞系, 采用间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术、Western blot方法、荧光素酶活性检测、Super-EMSA方法和流式细胞术, 探讨LMP1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节功能. 结果表明, LMP1介导的c-Jun/Jun B异源二聚体可下调p16启动子活性及其表达, 并影响细胞的演进. 该研究在AP-1信号传导通路和细胞周期之间建立了新的直接联系, 从而为肿瘤发病机制研究提供了新的思路和实验模式.     

耳蕨属(鳞毛蕨科)的亚洲起源: 来自rbcL序列的证据

对60种(包括新测定的我国西南部的耳蕨和贯众属植物23种)广义耳蕨属Polystichum sensu lato (s.l.)植物的rbcL基因序列进行系统发育分析, 并根据通过相对速率检验支系之间的遗传距离和rbcL基因的进化速率, 估算广义耳蕨属起源和发生分歧的时间. 用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)构建的系统发育树基本一致, 所分析的广义耳蕨属(包括贯众属Cyrtomium和鞭叶蕨属Cyrtomidictyum)构成一个单系群, 支持广义耳蕨属的成立. 位于系统树基部的支系均由来自亚洲的种类构成, 而来自全世界各地的其余种类构成另一个支系. 系统发育分析及分歧时间的估算结果显示, 广义耳蕨属在晚白垩世晚期(约76 Ma)首先从亚洲起源, 在始新世早期(约46 Ma)扩散到世界各地.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

κ改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α 诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1AΔ)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α )诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1AΔ能抑制由TNF-α 诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因——E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

晚上新世南海北部底栖有孔虫Bulimina alazanensis含量变化及其原因探讨

南海北部大洋钻探184航次1146站晚上新世以来的研究发现, 底栖有孔虫Bulimina alazanensis 的含量3.2～2.0 Ma BP逐渐减少, 并在2.1 Ma BP前后发生锐减, 其变化幅度达90%. 其他底栖有孔虫属种如Globobulimina subglobosa和Cibicidoides wuellerstorfi的含量则是在2.1 Ma BP之前较低, 而2.1 Ma BP之后增加. 对比浮游、底栖有孔虫的氧、碳同位素变化, 发现 B. alazanensis 的含量变化与氧、碳同位素的波动相对应: 当氧同位素值较轻, 即暖期时, 该种的含量处于峰值; 而当氧同位素值变重时, 该种含量也降低. 与碳同位素变化对比, 该种的高峰值分别与底栖有孔虫碳同位素的高值、浮游有孔虫碳同位素的低值对应. 结合北极冰盖扩张、东亚冬季风加强、表层生产力增加等诸多因素, 认为晚上新世由巴士海峡进入南海的深层水由较暖、溶解氧含量较高的西太平洋深层水团, 在2.1 Ma BP前后, 变为溶解氧含量较低的中层水团, 同时随着北极冰盖的扩张, 东亚季风的加强, 南海表层海水生产力增 加, 底层海水逐渐富营养且缺氧, 逐渐对B. alazanensis的生产形成压力, 导致该种自3.2 Ma BP开始含量逐渐降低, 并在2.1 Ma BP前后达到最低.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.