秀丽隐杆线虫胆固醇7,8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

胆固醇7,8–脱氢酶是参与胆固醇代谢的还原酶,可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇(合成维生素D3的重要中间体).合成秀丽隐杆线虫的胆固醇7,8-脱氢酶基因daf-36,与具有T7强启动子的载体pET32a(+)连接后,成功构建pET32a-daf-36表达质粒,转入大肠杆菌表达系统E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3),经过IPTG诱导培养,蛋白质电泳图谱及质谱结果表明此酶得到了高效表达.     

大肠杆菌丁醇生产菌的构建及检测

用合成生物学和代谢工程技术,筛选并克隆丁醇合成途径中酶活性较高的atoB,hbd,crt,ter,adhE2等5个关键酶基因,先通过重组PCR构建pUC18-ato B-hbd-crt-ter质粒,再将串联基因atoB-hbd-crt-ter和基因adhE2克隆至质粒pET-21b中,构建含丁醇合成途径的表达载体p ET-21b-ato B-hbd-crt-ter-adh E2,将其转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中制备工程菌株.对样品进行IPTG诱导表达检测与色谱分析的结果表明,已合成出关键酶蛋白并产生一定量的丁醇.     

亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择

以ZG1( )、ZG1(-)、ZG2( )、ZG2(-)、ZG3( )、ZG3(-)寡聚核苷酸片段为材料，合成了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA必需的35个氨基酸的折叠片段，将此片段分别克隆到pET3b质粒和pBLZ质粒中．酶切后用2％琼脂糖电泳检测证明两者克隆成功．将这2种重组质粒分别转化到E.coli DH5a中．发现pET3b重组体在E．coli DH5a中表达成功．而pBLZ质粒重组体在E．coli DH5a中不能成功表达；从转化子中分离得到重组质粒pET3b,酶切和序到分析都证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因．     

大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在野生型专性自养嗜酸性氧化硫硫杆菌Tt-Z2中的表达

利用PCR技术扩增E．coli K-12磷酸果糖激酶-1基因(pfkA)，将该基因与广泛寄主的IncQ质粒pJRD215连接构建重组质粒pSDK-1，该质粒可与pfk基因缺陷株E．coli DF1010互补．通过接合转移的方式将其导入专性自养极端嗜酸性氧化硫硫杆菌Tt-Z2中并得到表达．pSDK-1在宿主Tt-Z2中有较好的稳定性，在无选择压力条件下连续传50代仍可保留68％．酶活性测定表明，pSDK-1的pfkA基因在缺陷株E．coli DF1010中表达水平略高于出发菌株E．coli K-12；而在氧化硫硫杆菌中则以较低水平进行表达．葡萄糖可促进含pSDK-1的氧化硫硫杆菌Tt-Z2的生长，而对照菌株的生长则未受明显影响．说明重组菌可部分利用葡萄糖作为碳源而生长．     

大肠杆菌ppsA,pckA基因的克隆与串联表达

磷酸烯醇丙酮酸合成酶（ppsA)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（pckA）是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的2个关键酶，在大肠杆菌中分别由ppsA和pckA基因编码，首先用PCR方法从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增得到了ppsA和pckA基因，并将ppsA,pckA以单独或串联的方式克隆到大肠杆菌表达质粒pλPR上，构建成的质粒pλPR-ppsA,pλPR-pckA,pλPR-ppsA-PckA导入E.coli P2392菌株中表达，结果表明，ppsA,pckA基因的单独表达使宿主细胞的ppsA和pckA酶活力分别提高到5．2和2．5倍，串联表达使宿主细胞PAt和PckA酶活力分别提高到3．1和2．3倍，还使得以PEP为底物合成的3－脱氧α－阿拉伯 酮糖－7－磷酸（DAHP）产量提高到2．1倍，2个基因串联表达比单个基因表达更有利于提高DAHP的产量。     

hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定

基于人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的氨基酸序列,按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成基因,并克隆到pMAL-c2x载体中,与MBP蛋白mal E基因融合表达,获得重组表达质粒pMAL-hIAPP.将质粒pMAL-hIAPP转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中,利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白MBP-hIAPP表达.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白MBP-hIAPP的相对分子质量约为4.9×104.利用重组型烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶(rTEV)酶切MBP-hIAPP,并采用凝胶过滤层析的方法分离出高纯度的hIAPP,利用MALDI-TOF质谱进行了验证.     

产毒性大肠杆菌CFA／I基因表达与DNA超螺旋状态的关系

将CFA／I结构基因(cfaABCE)克隆到载体pJRD184上构建了质粒pJGX15A，并将其转入大肠杆菌fDpA野生株E．coli HB101和topA缺陷株E．coli DM800中．Western blot测定的结果表明，在CFA／I的正调控基因cfaD基因缺失时，两株重组菌株都能够表达CFA／I抗原．分别抽提两个重组菌株对数前期和对数中期的质粒pJGX15ADNA，并对其进行氯喹琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示E．coli DM800细胞中质粒pJGX15A的负超螺旋水平比野生型细胞E．coli HB101中的较低．同时，菌落免疫酶斑分析的结果显示DM800受体菌中CFA／I的表达水平比HB101受体菌中的表达水平高．实验结果表明，CFA／I结构基因的表达与DNA负超螺旋水平有明显的负相关性，与负超螺旋促进基因表达的看法不同．     

大肠杆菌麦芽糖转糖基酶 MalQ基因克隆与融合表达

用PCR方法获得E.coli K12 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pET-DsbA中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的E.coli K12 MalQ基因的同源性高达99％。重组质粒转化E.coli BL21(DE3) plysS,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与DsbA表达的融合蛋白在目标位置约103kDa处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液酶处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b，获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下，人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达，表达量占菌体总蛋白的24％，表达产物以包函体存在，Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas．mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种；但由于其可利用的碳源范围窄,所以对其进行基因工程改造首先需要有较好的载体系统．以Z．mobilis内源质粒pZM2和大肠杆菌(E．coli)质粒pBR328、pACYC184为出发质粒,构建了三个Z．mobilis-E．coli之间的克隆型穿梭质粒,即pZB1、pZB21和pZB31．对它们在Z．mobilis CP4中的稳定性、拷贝数的初步比较分析表明：pZB21最稳定、拷贝数最高,pZB31次之,pZB1最差．进一步以pZB21为载体,在Z．mo- bilis CP4中表达E．coli的talB基因,酶活水平为0．087 U/mg蛋白．证明pZB21是能用于基因表达的、较为理想的Z．moblis-E．coli之间的穿梭载体．     

大肠杆菌pheA与tyrB基因的克隆与串联表达

为探讨用基因工程的手段改良苯丙氨酸的发酵菌株，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，从大肠杆菌总ＤＮＡ中克隆得到了编码苯丙氨酸合成途中的两个关键酶基因－即分枝酸变位酶（ＣＭ）／预苯酸脱水酶（ＰＤ）基因ｐｈｅＡ与苯丙氨酸转氨酶（ＰＡＴ）基因ｔｙｒＢ，在大肠杆菌中进行了这两个基因的单个和串联表达。ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ基因分别都能在λ噬菌体的ＰＲ启动子之后得到较大量的表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现清晰的条带，     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L–组氨酸生物合成途径,以提高L–组氨酸的产量.用NTG诱变大肠杆菌M-17(SGr),依次赋予其2–噻唑丙氨酸(2-TA)和组氨酸氧肟酸盐(HisHx)遗传标记,再以突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his-operon,将重组质粒导入突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)得到工程菌E.coli M-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pUC118-his-operon).根据zwf和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E.coli M-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L–组氨酸的产量.摇瓶发酵结果显示,L–组氨酸产量与对照株相比,工程菌E.coli M-19提高了4.5倍,双质粒系统重组工程菌E.coli MZH-19、E.coli MPH-19和E.coli MZPH-19分别提高了5.14、5.78、8.43倍.     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

氧化硫硫杆菌重组质粒pSDT125的构建及其在大肠杆菌之间的转移

对氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)隐蔽性质粒pTt12进行了限制性酶切分析,并绘出了限制性酶切图谱,其大小为13.7Kb.将pTt12质粒与pBR325质粒重组,得到了重组质粒pSDT125(Cm',Ap',Tc~s).氧化硫硫杆菌重组质粒pSDT125本身不具有接合转移能力,但它在广泛寄主范围的转移性质粒RP4的带动下以较高的频率在大肠杆菌(Escherichia coli)之间转移,表明在氧化硫硫杆菌质粒pTt12上存在着与接合转移有关的DNA序列.     

人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ Ｈ Ｉ Ｖ２） 的原病毒基因组为模板,通过套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增得到了 Ｈ Ｉ Ｖ２ 的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｘ５ Ｘ１ ,获得了重组表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ３６ Ｅ Ｎ Ｖ． Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 对重组表达菌株诱导后, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）成熟肽的cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a( )中构建表达质粒pET-EC-SOD，表达菌株用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达3h-5h后，产生较多的重组人EC-SOD，并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的26%以上。经纯化和复性后的EC-SOD比活为每毫克纯化酶蛋白1200U。将EC-SOD转染粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SOS-PAGE分析结果表明，粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为28ku的特异蛋白质带，Western blot分析表明，该特异条带即为EC-SOD蛋白，连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物260U。