CRISPR/Cas9技术联合AAV对Rosa-mTmG小鼠的MEF细胞进行编辑

目前,基因编辑技术已被广泛用于生物医学研究,本研究利用AAV(Adeno-Associated Virus)递送CRISPR/Cas9系统,实现高效率的基因编辑,并对特定组织细胞中的基因编辑进行了初步探索.我们首先采用Rosa-mTmG转基因小鼠来研究CRISPR/Cas9在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)中的编辑效率;接着,我们构建了能够被AAV包装的SaCas9系统,并通过瞬转以及AAV介导递送的方式检测其基因编辑效率;最后,我们还构建了含有心肌特异启动子的cTNT-PX601-sgRNA以备后续研究.结果发现,与瞬转相比,AAV介导CMV-PX601-sgRNA在体外能够极大地提高细胞的基因编辑效率.另外,cTNT-PX601-sgRNA能够在心肌细胞中特异表达.我们的结果表明,利用AAV介导的CRISPR/Cas9系统在体外可以实现高效地基因编辑,为靶向修复基因缺陷疾病,特别是特定组织器官中的基因缺陷,提供了研究工具和实验依据.     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

利用CRISPR/Cas9系统建立成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型

目的 利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性OGA在成体心脏稳态维持中的功能。方法 首先,筛选靶向Oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心肌细胞特异性SpCas9表达小鼠(α-MHC^Cas9),并通过腹腔注射方式将AAV9-sgOga注射到小鼠体内。通过qPCR和Western blot印记杂交实验检测Oga的表达情况,确定Oga敲除是否成功。最后,通过组织学分析心脏结构,以及超声心动图分析心脏功能,来分析Oga对心脏稳态维持的影响。结果 筛选到2条可以有效靶向Oga编码区的sgRNA,通过AAV9递送实现了Oga基因在心脏组织的有效敲除,且导致O-GlcNAcylation表达显著上升;组织学分析和超声心动图分析发现基因敲除小鼠心脏结构及功能在基础水平与对照小鼠无显著变化。结论 利用AAV9介导的CRISPR/Cas9系统成功建立了成体心肌细胞Oga基因敲除的小鼠模型,为研究OGA介导的O-GlcNAcylation清除在心脏稳态维持中的功...     

水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测，本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统，根据PPARD基因结构和序列特点，设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列，将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞，提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后，通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白，利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现，PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比，PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体，并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑，将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率，推进对PPARD基因的功能研究。     

利用CRISPR/Cas9敲除小鼠低温诱导蛋白(CIRBP)基因

为研究冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)与多种疾病的关系,利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的CIRBP基因.针对CIRBP基因编码序列设计向导RNA(single guide RNA,sgRNA),构建相应sgRNA表达质粒.将此sgRNA与Cas9蛋白混合,注射C57BL/6小鼠的受精卵,实现靶基因敲除.通过T7E1酶切实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变位点.获得了8个CIRBP基因突变的首建鼠,8只小鼠发生不同程度的碱基缺失.     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

用CRISPR/Cas9系统构建dXPR1的果蝇突变体品系

XPR1是一种细胞无机磷酸盐输出蛋白的编码基因,其突变会导致原发型家族性脑钙化(primary familial brain calcification,PFBC). XPR1在果蝇中同源基因为CG10483(d XPR1).使用CRISPR/Cas9系统,通过构建引导Cas9内切酶的sgRNA表达载体,并将其注射到表达Cas9酶的果蝇卵中,构建了d XPR1大片段缺失果蝇品系即d XPR1无功能突变体(d XPR1-).通过观察d XPR1-的表型从而初步判断XPR1基因对神经系统发育的影响,为进一步的XPR1基因功能与致病机制的研究提供基础.     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因

低植酸是作物育种目标之一,然而植酸对植物自身的影响至今未有科学评估.为此,在建立粳型常规水稻"金粳818"再生体系基础上,利用农杆菌介导的遗传转化方法将针对植酸合成最后一步磷酸化反应的1, 3,4, 5, 6-五磷酸肌醇2-激酶基因IPK1构建的3个CRISPR/Cas9载体分别转入"金粳818".分子检测发现,再生的42株植株中,40株为转化株,显示转化率高达95%.靶点序列分析发现,26株绿色转化株中,1株基因组发生了编辑.编辑株靶点测序发现,除碱基缺失外,附近序列错配达30%.这些结果为水稻低植酸种质的创制及植酸的功能分析奠定了技术基础.同时,本文对水稻再生株的白化现象进行了探讨.     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

基于CRISPR/Cas9技术构建TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结直肠腺癌细胞Caco-2中的辣椒素受体基因TRPV1,构建TRPV1基因敲除的Caco-2稳定细胞系.使用CRISPR/Cas9在线靶点设计程序在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中设计一对gRNA,将gRNA构建到真核重组表达质粒的载体上,电转染待敲除细胞,经嘌呤毒素抗性筛选和基因测序获得敲除TRPV1基因的稳定细胞系.用Western Blot检测TRPV1基因蛋白表达量验证Caco-2中TRPV1基因的敲除效果,CCK-8检测TRPV1基因敲除细胞的生长曲线,与野生型细胞对比检测TRPV1基因敲除对细胞生长的影响.筛选出TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,而且TRPV1基因敲除对Caco-2细胞生长无显著影响.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,为后续研究辣椒素对肠道脂类吸收影响的机理研究提供了有利的工具.     

第二大类CRISPR-Cas系统在肿瘤研究的应用

第二大类CRISPR-Cas系统具备多重基因编辑修饰功能,仅由单效应蛋白介导完成干扰过程,包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统,及识别并切割单链RNA的Cas13系统.综合介绍第二大类CRISPR-Cas系统的结构与功能基础、作用机制,及其在构建肿瘤模型、肿瘤免疫治疗、耐药性研究、核酸检测等方面的应用,为进...     

一个烟草PR-1a启动子的克隆及序列分析

通过PCR扩增，从烟草Nicotiana tabacum cv Samsun中克隆了水杨酸诱导表达的病程相关蛋白PR-la基因的启动子TP12，以期用于构建诱导表达基因敲除系统，并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。启动子的克隆产物经正反两向测序后，拼接分析结果表明，扩增得到的PR-1α基因启动子长1313个碱基，序列富含AT，其中A T占71．67％，与已报道的序列比较，核苷酸的相似性为98．6％。     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9在小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的效率比较

哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,构建了一个无启动子的pTyr-2A-DsRed同源重组质粒供体,选择Rosa26的第一个内含子作为外源基因整合的靶位点,设计了切割位点几乎一致的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。通过流式对比分析C_2C_(12)细胞中红色荧光蛋白DsRed的表达水平,比较了3种基因组编辑工具介导的外源基因定点整合效率,结果发现CRISPR/Cas9的效率最高,在此基础上,利用CRISPR/Cas9将供体整合到小鼠胚胎干细胞中,筛选单细胞克隆进行囊胚腔注射和胚胎移植,获得一只存活的嵌合体小鼠,表现出白毛中夹杂黑毛的表型,表明整合到小鼠Rosa26的Tyr基因可以正常表达。     

风疹病毒E1抗原基因片段的拼接及原核表达

应用基因克隆技术,对风疹病毒E1抗原基因片段进行拼接及克隆表达．根据软件GOLDKEY预测E1抗原的主要抗原决定簇位点E1(243～286aa),再设计4条近60个碱基长引物,利用PCR仪延伸合成目的基因,酶切并构建重组表达载体,酶切与测序鉴定,再转化表达菌株BL21(pLYS),IPTG诱导表达,行SDS-PAGE检测到目的基因表达成功．结果实现了用基因克隆技术将含E1(243～286)片段的pETKDO载体向大肠杆菌的转化,IPTG诱导2h,获得的表达量高。     

利用CRISPR-Cas9系统高效创制水稻品系“17318”的 OsGW2、OsGN1a基因定向突变体

CRISPR-Cas9系统在水稻功能基因的功能研究、性状改良与分子设计育种中起着重要的作用。本研究成功构建了水稻高效定向敲除OsGW2和OsGN1a的CRISPR/Cas9载体pZJP049。并将该载体通过农杆菌介导转化水稻"17318"愈伤,获得水稻再生苗。PCR扩增的方法进行转基因植株阳性检测,结果显示阳性率为100%。PCR-RFLP结果表明OsGN1a基因位点的突变效率为77.7%。PCR-SSCP检测结果显示OsGW2基因位点突变率为100%。双基因聚合突变体(gw2gw2gn1agn1a)的种子在长度和宽度均有明显增加,与预期一致。本研究通过CRISPR-Cas9系统快速聚合Gn1a, GW2基因,实现了目标性状的精确改良。