几种因素对重组大肠杆菌目标蛋白表达的影响

应用基因工程技术 ,获得能表达蛋白B的重组大肠杆菌 .在摇床条件下 ,研究了几种因素———IPTG浓度、接种不同初始浓度的菌种及培养温度对目标蛋白表达的影响 .结果表明 ,IPTG浓度在常规用量 1mmol/L的基础上降低至 0 .2mmol/L时 ,目标蛋白的表达量无显著差异 ;菌种初始浓度并非越大越好 ,结合表达量 ,作者认为 ,在 1∶80时较适宜 ;培养温度为 37℃对菌株目标蛋白的表达明显好于 30℃ .     

酵母细胞表达金属硫蛋白对铅离子的吸附研究

根据人肝金属硫蛋白的基因序列,结合酿酒酵母菌密码子使用规律,改造并合成了可在酵母细胞内高效表达的金属硫蛋白基因,并将该基因转入酵母细胞内进行了表达.以野生型菌株为对照,初步测定了酿酒酵母INVSC1-mt菌株对pb2+的吸附作用.研究结果表明,金属硫蛋白基因的表达有助于提高酿酒酵母细胞对pb2的吸附作用,其最大吸附量比野生型菌株提高了11％.同时,酿酒酵母INVSC1-mt菌株吸附pb2+的速度较快,在30 min时,其吸附率就达到了96.03％,吸附量为5.76 mg/g湿重细胞.而野生型菌株至120 min时,其吸附率才达到90.44％.     

人超氧化物歧化酶-过氧化氢酶融合基因的构建、表达及其产物的初步纯化和性质研究

尝试应用基因工程技术制备一种兼具人超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的双功能融合蛋白CAT-PTD-SOD,其中的PTD是序列为RKKRRQRRR的短肽.首先通过重叠PCR构筑CAT-PTD-SOD融合基因,然后把该基因转化进入大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)菌株.通过SDS-PAGE、CAT和SOD活性分析以及分离纯化组分的分析确认该重组菌株能够表达CAT-PTD-SOD,其表达量可达总蛋白的8.9%,SDS-PAGE显示其分子量约为85 kD.可溶性实验发现该融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在.抗H2O2能力实验表明CAT-PTD-SOD具有很好的抗H2O2能力,在0.033 mol.L-1、甚至0.067 mol.L-1的H2O2溶液中,其SOD活性20 min内无明显下降.     

HAC1基因过表达对重组人CTLA-4蛋白在毕赤酵母中分泌表达的影响

重组人细胞毒性T细胞相关抗原(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4,CTLA-4)是一类重要的基因工程药物,其在毕赤酵母中表达水平偏低使其一直无法广泛应用于临床治疗.而影响毕赤酵母中的外源蛋白分泌表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力.本文通过在毕赤酵母细胞中过表达HAC1基因对毕赤酵母细胞中未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)的信号通路进行调控,从而改善了CTLA-4蛋白的表达水平.摇瓶中改造菌株M-HAC1发酵上清液中该蛋白的分泌表达量是原始菌株表达量的2.55倍.     

HIV-TATm-Survivin(T34A)高表达大肠杆菌BL21(DE3)菌株的自适应进化筛选及其特性

表达蛋白HIV-TATm-Survivin(T34A)的重组大肠杆菌BL21(DE3)在长时间保存后其表达水平明显下降,发酵罐放大难以顺利进行。利用该蛋白的本底表达对宿主菌产生的生长压力进行了实验室自适应进化工作,得到携带相同质粒但表达水平呈两极分化的两类菌株HTS1和HTS2。摇瓶培养时,HTS1菌株生长较迅速,但重组蛋白几乎无表达;HTS2生长较缓慢,却可以高效积累重组蛋白。因此HTS1菌株的出现,可能是原始菌株长时间保存后蛋白表达能力下降的原因之一。另外,HTS2菌株应用上的优势,外源添加高达300 mmol/L的乙酸钠对HIV-TATm-Survivin(T34A)的表达水平没有较明显负的影响,4 L和30 L发酵罐表达验证了摇瓶培养的结果。     

靶向抗肿瘤GnRH-PE39KDEL融合蛋白表达培养基的优化

通过筛选培养基、单因子筛选试验及正交试验进行摇瓶发酵,确定适合该菌株表达融合蛋白的最佳培养基配方。采用该优化培养基可使抗肿瘤GnRH-PE39KDEL融合蛋白表达量占总蛋白的34.5%,占可溶蛋白的40%。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

苏云金芽孢杆菌cyt1Aa基因在拟步甲亚种菌株中的表达及重组菌株杀虫活性研究

将含苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,简称Bti)cyt1Aa基因的质粒电激转化至对鞘翅目害虫有专一活性的Bt拟步甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis,简称Btt)菌株中进行表达,获得重组菌株Btt-WF45。对表达产物进行SDS-PAGE分析,显示Cyt1Aa蛋白获得了大量表达。生物测定结果表明,Btt-WF45对鞘翅目小圆叶甲(Plagiodera Redtenbacher)幼虫没有毒力,对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的毒力比对照菌株4Q7-WF45高0.33倍,对白纹伊蚊(Aedes albopictus)的毒力比4Q7-WF45高0.63倍。由于在重组菌株Btt-WF45中Cry3A蛋白的表达量太低,所以在该结果中未能显示Cyt1Aa蛋白与Cry3A蛋白是否存在协同增效作用。     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

藻胆蛋白表达条件优化的研究

为了提高藻胆蛋白的表达含量,对本实验室构建的含pACYCDuet-ho1-pcyA、pETDuet-pecE-pecF、pCO-LADuet-pecA的E.coliBL21菌种的表达条件进行优化。通过单因素实验和正交实验L9（33）优化了蛋白的表达条件为：诱导表达温度为28℃,诱导表达时间为14h,诱导剂量为1.0mmol/L,藻胆蛋白最高表达含量为11.271mg/100mL.     

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。     

共表达KnobS蛋白与LTB蛋白的重组干酪乳杆菌构建

在干酪乳杆菌中表达减蛋综合征病毒纤维蛋白KnobS,并分析其抗原性。分别将编码减蛋综合征病毒主要免疫保护性抗原纤维蛋白KnobS与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入干酪乳酸杆菌分泌表达载体pMG36e-UP/L中,成功构建重组表达载体pMG36e-UP/LTB-KnobS,获得表达融合蛋白KnobS-LTB的重组乳酸菌干酪乳杆菌表达系统;经SDS-PAGE和Western-blot检测表明,有大小约41kD的蛋白表达,具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。在干酪乳杆菌中成功地表达了含减蛋综合征病毒抗原的融合蛋白KnobS-LTB,且具有较好的抗原性,为减蛋综合征病毒重组乳酸菌活菌口服疫苗的研制奠定重要的物质基础。     

Lp-1643蛋白单一结构域的黏附功能研究

从植物乳杆菌KLDS 1.0320中克隆出Lp-1643蛋白N端的第一个结构域基因,与表达载体pET30a连接后成功构建重组质粒pET30a/N1。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,以IPTG进行诱导,重组蛋白以可溶形式成功获得表达。通过亲和色谱技术用HisTrap FF柱对重组蛋白进行了分离纯化。以BSA作为对照,研究了重组蛋白His-N1对KLDS 1.0320菌株黏附Caco-2细胞的影响,发现用该重组蛋白预处理Caco-2细胞之后,其上黏附的KLDS 1.0320数量显著减少（P<0.05）。这说明Lp-1643蛋白N端的第一个结构域具有黏附Caco-2细胞的功能。     

由单阶跃应变试验预测两阶跃应力松弛

从分析非线性粘弹性体单阶跃应力松弛函数的性质入手，指出内蕴时标对应变历程的依赖关系，从而修正了两阶跃应力松弛的表达式。在八种不同情况下，这些表达式的计算曲线与两阶跃应变试验的实测点都很吻合。     

重组质粒pMG36e-nisI-gfp在乳酸菌中的应用

本研究将带有nisI和gfp(绿色荧光蛋白)基因的乳酸菌表达栽体pMG36e-nisI-gfp转化至乳酸菌中,观察其在宿主内的稳定性.对重组菌进行了菌体形态、传代培养、质粒验证等研究,考察了该质粒的稳定性.结果显示:重组菌在不含抗生素的培养基中连续传代20代后,质粒丢失率低;菌体大小和形态基本不变;质粒经HindⅢ酶切后大小不变;GFP在第0、5、10、15和20代宿主菌中都可以表达,表达量没有明显差别,在SDS-PAGE中的带型一致;初步的动物实验验证了该质粒作为遗传标记的应用效果.说明该质粒在宿主菌中具有良好的稳定性.     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析

通过RT-PCR获得SARS冠状病毒N蛋白基因，分别克隆到原核表达载体pET21a，pET32a和pGEX-4T-1中，将3种重组质粒pET2la-N，pET32a-N和pGEX-4T-1-N分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，细菌中分别表达出约46kD的重组N蛋白、约60kD的6xHis-N融合蛋白和约70kD的GST-N融合蛋白，表达量分别达总蛋白的45％、40％和30％．进一步的分析表明：6xHis-N融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达，该可溶性组分占细菌裂解液的70％左右，且能被6xHis抗体所识别．用蛋白分析软件对N蛋白进行了序列分析和二级结构预测．SARS冠状病毒N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，有助于进一步结晶后进行X射线晶体衍射分析其结构与功能．     

Engineering Deinococcus radiodurans into biosensor to monitor radioactivity and genotoxicity in environment

Based on a genetically modified radioresistant bacteria Deinococcus radiodurans, we constructed a real time whole cell biosensor to monitor radioactivity and genotoxicity in highly radioactive environ-ment. The enhanced green fluorescence protein (eGFP) was fused to the promoter of the crucial DNA damage-inducible recA gene from D. radiodurans, and the consequent DNA fragment (PrecA-egfp) car-ried by plasmid was introduced into D. radiodurans R1 strain to obtain the biosensor strain DRG300. This engineered strain can express eGFP protein and generate fluorescence in induction of the recA gene promoter. Based on the correlation between fluorescence intensity and protein expression level in live D. radiodurans cells, we discovered that the fluorescence induction of strain DRG300 responds in a remarkable dose-dependent manner when treated with DNA damage sources such as gamma radiation and mitomycin C. It is encouraging to find the widely detective range and high sensitivity of this re-constructed strain comparing with other whole cell biosensors in former reports. These results suggest that the strain DRG300 is a potential whole cell biosensor to construct a detective system to monitor the biological hazards of radioactive and toxic pollutants in environment in real time.     

内蒙古盐碱湖一株编码细菌视紫红质的嗜盐古菌bop基因全序列克隆及表达

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR)是由bop基因编码的唯一膜蛋白,具有光推动质子泵的作用,为生命活动提供所需要的能量。为了研究高表达且具有生物活性的BR蛋白,应用PCR扩增技术,从内蒙古额吉淖尔盐碱湖分离得到的一株嗜盐古菌中扩增得到bop基因全序列;并构建了具有His6标签的原核表达载体p ET28a-IM-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达BR;并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定分析。结果显示获得的bop基因全序列开放阅读框为672 bp,编码223个氨基酸,含有重组质粒p ET28a-IM-1的阳性菌株在IPTG诱导下高效表达了分子量约为25 k Da的BR蛋白。同源性分析表明该BR蛋白结构在古菌与细菌中具有相对较高的保守性,这与其质子泵功能密切相关。该BR蛋白为新发现的细菌视紫红质,其基因序列已递交Gen Bank,其登录号为KT873301。     

产广谱细菌素乳酸菌的筛选

利用牛津杯双层平板法从70株乳酸菌中筛选得到2株具有较高抑菌活性的乳酸菌LAB30、LAB211。研究这2株乳酸菌的抑菌物质发现：排除酸性产物乳酸、乙酸以及过氧化氢的干扰,LAB211和LAB30仍具有较高的抑菌活性;对其发酵液进行蛋白酶处理,LAB30的发酵液经胰蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌活性均有降低;而LAB211的发酵液经蛋白酶K处理后有所降低,胰蛋白酶处理没有变化,因此可以判定这两株乳酸菌产生的抑菌物质为细菌素。利用特异性引物PCR分析可知,LAB211和LAB30产生的细菌素并非nisin。抑菌谱实验表明,LAB30和LAB211的发酵液不仅抑制革兰氏阳性菌,而且对部分革兰氏阴性菌也有抑制作用。因此LAB211和LAB30产生的是一类广谱细菌素。