感染番茄抗病品种的番茄黄化曲叶病毒的基因变异

近几年来,生产中发现一些番茄抗病品种在不同环境条件下或应用几年后出现感病现象。为了解不同抗病品种中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)基因变异的情况,对5个感染TYLCV的番茄抗病品种进行了TYLCV全长基因克隆和序列测定。扩增结果显示,5个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781 bp,且均编码6个功能蛋白。基因组序列比较发现,这5个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到99%以上;通过功能蛋白比对发现,复制增强因子AC3蛋白存在变异,同世界各地报道的TYLCV-Israel株系典型分离物的AC3蛋白存在7处氨基酸差异的位点。分析结果表明,这五个病毒分离物均属于TYLCV-Israel株系,其AC3蛋白的氨基酸序列变异程度均不显著,并没有产生新的病毒株系。     

番茄黄化曲叶病毒北京分离物的全基因组序列测定及进化分析

番茄黄化曲叶病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)在我国危害日益严重.为了对该病进行深入有效的了解,根据已知的番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)基因组DNA-A序列的保守区段,设计两对背向引物;针对北京地区的3个TYLCV分离物进行分子鉴定.结果显示该分离物为单组分病毒,不含DNA-B和卫星DNA-β,是TYLCV的2个新分离物.TYLCV-BJ1与BJ2基因组全长分别为2781bp和2779bp,同源性为99.8%,都编码6个开放阅读框.对TYLCV的分子进化分析表明,国内现已发现的TYLCV株系亲缘关系都很接近,同源性在97.1~99.9%,属于以色列TYLCV-IL株系进化下的一个近代分支.从全基因组和各基因的逐个比对结果看,TYLCV的AV1和AV2保守性最高,其次是AC2和AC3.当TYLCV-Mld进化成TYLCV-IL时,AC1和AV4基因发生了较大的变化,IR区的同源性更是从小于70%上升到94.3%.国内的TYLCV株系分成2个亚群,但在地理分布上没有形成严格的区域限定,北京分离物属于CN I亚群.     

番茄黄化曲叶病毒自然种群的分子变异和进化研究

研究目的：创新要点：研究方法：重要结论：2006年我国上海首次发现番茄黄化曲叶病毒（TYLCV），随后TYLCV迅速蔓延至全国13个省份和自治区。本研究分析了2006至2010年期间TYLCV在我国首发地上海市的分子变异规律。本研究持续五年追踪田间TYLCV，分析TYLCV的全长基因组序列、分子变异及种群遗传结构，为防控TYLCV提供理论依据。2006至2010年从上海采集了26个TYLCV的分离物，利用高保真性的滚环扩增技术获得TYLCV分离物的全长基因组。应用MEGA5等生物信息学软件分析TYLCV的分子变异。TYLCV自然种群具有与RNA病毒相似的突变率，以基因间隔区的分子变异最大，平均突变率为4．81×10-3（见图2和表2）。TYLCV的大部分基因都处于负向选择，但包含在c1开放阅读框内的C4，却与c1承受着不同的选择压而处于正向选择（见图3和表6）。     

番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆的构建

为研究番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的基因功能及相关致病机理,构建了2种TYLCV的侵染性克隆。将两端含有间隔序列(intergenic sequence,IR)的TYLCV全基因组片段分别克隆到质粒p UC57和p CAMBIA2300上得到侵染性隆p TYLCV1.X和p CB2300-1.X。利用质粒p TYLCV1.X直接注射法与p CB2300-1.X的农杆菌浸润法分别接种番茄植株。结果显示:侵染性克隆p TYLCV1.X在注射番茄6周后出现系统症状,侵染效率为23.1%-42.1%;农杆菌浸润法接种的植株4周后观察到明显的病害症状,侵染效率为87.5%-100%。PCR检测结果证明2种侵染性克隆均可在番茄体内产生完整的病毒基因组DNA,实时定量PCR测定病毒浓度可达102个/番茄细胞。以上结果表明,含有2个IR的TYLCV基因组载体具有侵染活性。     

侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT—PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RTPCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2（BBWV2）基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNAl和RNA2具有高的序列同源性,分别为76．6％～94％和76．9％～94．1％,而与BBWVl的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种（品系）加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53．3％,并且供试20品种（品系）均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。     

侵染番茄的中国番茄黄化曲叶病毒致病性相关分子的遗传多样性

对云南番茄中的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)不同分离物的致病性相关分子DNAβ进行PCR扩增和克隆.全序列比较分析发现滇西北和滇南各分离物DNAβ同源率较高而且进化关系较近,滇西南与之差异较大.获得的16个DNAβ分离物具有一定的地理分布差异.     

云南3个不同地区水稻矮缩病毒S8片段的序列分析

用RT-PCR方法从云南昆明、玉溪和陆良3个地区的水稻样品中扩增到水稻矮缩病毒S8全长片段,核苷酸测定及序列分析表明,水稻矮缩病毒云南昆明、玉溪及陆良分离物S8片段全长均为1356 bp,含一个1266 bp的ORF,编码421个氨基酸.核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4个中国分离物S8片段之间的核苷酸同源性为97.9%,其编码的氨基酸同源性为98.6%;4个中国分离物与日本分离物的S8片段核苷酸同源性和氨基酸相似性分别为94.7%和98.1%.昆明、陆良、玉溪和福建分离物应属同一株系,而日本分离物应属另一株系.     

黄瓜花叶病毒小青菜分离物RNA3全长序列分析

对侵染十字花科小青菜的黄瓜花叶病毒YN分离物（CMV-YN）RNA3进行全长克隆和序列分析．CMV-YNRNA3全长2220nt,分别编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP．序列同源性比较结果如下;CMV-YNRNA3核苷酸及其编码蛋白的氨基酸序列与亚组IA株系CMV-Fny、亚组IB株系CMV-Nt9、亚组Ⅱ株系CMV-Q的同源性,RNA3序列分别为92．7％、96．7％、74．2％,3a蛋白氨基酸序列分别为96．4％、98．6％、83．2％,CP氨基酸序列分别为97．7％、98．2％、83．1％．该结果表明CMV-YN与亚组IB株系CMV-Nt9的同源关系更密切．对CP核苷酸序列的系统进化树分析表明：CMV-YN归属于亚组IB,本研究为首次报道侵染我国十字花科植物的CMV基因组序列．     

蚕豆萎蔫病毒中国分离物RNA2全序列及多聚蛋白切割位点

对蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)分离物B935 RNA2全序列进行了测定,全长由3 601个核苷酸组成(不包括3'端Poly(A)).RNA2包含一个长的开读框,该开读框起始于231位,终止于3 428位,编码一个分子量为119 ku的多聚蛋白.对外壳蛋白亚基N端氨基酸序列测定表明外壳蛋白大亚基(LCP)和小亚基(SCP)是由119 ku多聚蛋白中谷酰胺与甘氨酸及谷酰胺与丙氨酸之间的切割产生的,LCP含有402个氨基酸,SCP含有197个氨基酸.与蚕豆病毒属(Fabavirus)病毒基因组核苷酸及编码的蛋白质氨基酸序列比较表明,B935与BBWV2分离物及广藿香轻花叶病毒具有很高的同源性,而与BBWV1分离物的同源性较低.B935与豇豆花叶病毒属(Comovirus)和线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的基因组结构相似,但序列同源性很低.B935与豇豆病毒属病毒的LCP和SCP氨基酸具有共同的保守序列.用4株单克隆抗体进行TAS-ELISA测定表明B935与BBWV1分离物(NRS和PH3)抗原上有差异.     

新疆加工番茄上一种类似南方番茄病毒的分子检测

在对加工番茄里格87-5进行RNA测序时,我们发现存在南方番茄病毒的基因组序列,序列包含STV除5′末端12bp和3′末端35bp的其它全部3390bp的RNA序列,其中只有5个碱基存在差异(与EF442780相比),说明里格87-5感染了STV。为了快速检测加工番茄品种的病毒感染情况,我们设计了STV特异性的PCR引物STV168F/STV745R,用一步法RT-PCR方法,从里格87-5的总RNA中扩增得到了预期的577bp的扩增产物,回收、克隆到pGEM-T上,提取质粒经EcoRI酶切鉴定后进行序列测定,与已报道的STV的序列同源性为99%～100%,表明该片段是STV特异性的。运用这项技术调查了20份加工番茄材料,结果显示,有3份材料的全部植株均带毒,13份材料均不带毒,另外4份材料部分带毒。同时,在新疆石河子蔬菜花卉研究所随机采集了加工番茄叶片样品,统计大田检出率约为28%。     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒（NDV）ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

Identification of a nanovirus-like DNA molecule associated with Tobacco curly shoot virus isolates containing satellite DNA

A circular single-stranded DNA molecule, designated DNA1, was identified from Tobacco curly shoot virus (TbCSV) isolates Y35 and Y115 containing satellite DNAβ using abutting primers based on the two reported DNA1 sequences of whitefly-transmitted geminiviruses, while DNA1 molecule was not found in TbCSV isolates Y1 and Y121 without DNAβ. The immunotrapping PCR test showed that DNA1 could be encapsidated in virus particles. Southern blot further confirmed that DNA1 molecules were only associated with TbCSV isolates (Y35 and Y115) containing DNAβ. Sequences of Y35 and Y115 DNA1 comprise 1367 and 1368 nucleotides, respectively, each having a conserved ORF encoding nanovirus-like replication-associated protein (Rep). A low nucleotide sequence identity was found between DNA1 molecules and their cognate DNA-As. Y35 and Y115 DNA1 shared 92% overall nucleotide sequence identity and 96% amino acid sequence identity for Rep, while 69%～79% overall nucleotide sequence identity and 87%～90% amino acid sequence identity were found when compared with two reported DNA1 molecules associated with Ageratum yellow vein virus and Cotton leaf curl Multon virus. Sequence analysis showed that DNA1 was less related to nanovirus DNA.     

Discovery and demonstration of small circular DNA molecules derived from Chinese tomato yellow leaf curl virus

Tomato yetlow leaf curl viruses betong to Begomoviruses of geminiviruses. In this work, we first found and demonstrated that the small circular DNA molecules were derived from Chinese tomato yetlow leaf curl viruses (TYLCV-CHI). These small circular DNA molecules are about 1,3 kb, which are half the full-length of TYLCV-CHI DNA A. It was shown by sequence determination and analysis that there was unknown-origin sequence insertion in the middle of the small molecules. These sequences of unknown-origin were neither homologous to DNA A nor to DNA B, and were formed by recombination of virus DNA and plant DNA. Although various defective molecules contained different unknown-origin sequence insertion, all the molecules contained the intergenic region and part of the AC1 (Rep) gene. But they did not contain full ORF.     

吐鲁番温室番茄病株及传毒烟粉虱的双生病毒检测与鉴定

为了明确吐鲁番地区温室番茄黄化曲叶病的病毒种类及传毒烟粉虱的生物型及携带病毒的情况,本研究利用番茄黄化曲叶病毒的特异引物通过PCR检测和DNA测序,对温室采集的43个番茄病株进行了病毒种类的分子鉴定;利用烟粉虱特异引物和番茄黄化曲叶病毒特异性引物通过PCR检测和DNA测序,对鄯善县温室采集的180头烟粉虱进行了生物型鉴定和带毒检测,并构建了双重PCR检测方法。结果显示:吐鲁番市和鄯善县温室发生的番茄黄化曲叶病的病毒种类为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),病株带毒率为39.5%。鄯善县温室发生的烟粉虱主要为Q型烟粉虱,带毒率为67.8%,是主要的传毒介体。本研究建立的双重PCR检测技术,能快速有效地确定Q型烟粉虱的生物型和携带TYLCV的情况。     

Tobacco curly shoot virus iso-lated in Yunnan is a distinct species of Begomovirus

Virus isolate Y1 was obtained from tobacco showing curly shoot symptoms in Baoshan, Yunnan Province. Whitefly transmission test and virion morphology observation showed that it is a begomovirus. In reactions with 14 monoclonal antibodies raised against begomoviruses, Y1 was readily differentiated from begomoviruses reported in China, Pakistan and India. The complete nucleotide sequence of DNA-A was determined, it contains 2746 nucleotides, with two ORFs in virion-sense DNA and four ORFs in complementary-sense DNA. Comparisons with total DNA-A, intergenic region and deduced amino acid sequences of individual ORFs showed that Y1 is a distinct Begomovirus species, for which the name Tobacco curly shoot virus (TCSV) is proposed. The total DNA-A of TCSV is most closely related to that of Tomato leaf curl virus from India (85% sequence identity). In contrast, the deduced coat protein of TCSV is most like that of Cotton leaf curl virus 72b isolate from Pakistan (98% amino acid sequence identity).     

大麦黄花叶病毒抗性突破株系的分子变异

通过大麦黄花叶病毒 (Ba YMV)抗性突破株系的核酸 RNA1全序列分析并与野生株系比较表明 ,抗性突破株系在病毒复制酶或转运蛋白区域 (6K2 )和核酸 RNA复制酶区域 (NIb)存在二个变异位点 .在这二个位点上抗性突破株系核酸分子编码的氨基酸分别为脯氨酸 (Pro)和苏氨酸 (Thr) ,而野生株系分别为缬氨酸(Val)和丙氨酸 (Ala) .对该两种酶蛋白质二级结构分析显示 ,氨基酸的变异可能导致了蛋白质的结构、功能与性质的改变 ,并且此种变异与抗 Ba YMV冬大麦中抗性基因 ym4的功能丧失有关 ,同时也说明了大麦品种田间致病性的差异与病毒核酸分子中的点突变关系密切 .     

痘病毒F10L基因的克隆及生物信息学分析

将古浪山羊痘病毒的基因组DNA提取出来,并设计引物进行PCR扩增,克隆F10L基因的DNA序列.为了分析山羊痘病毒F10蛋白的分子特征,将PCR产物连接到p GEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对F10L基因序列进行预测分析.结果显示,F10L基因序列由1 335个核苷酸组成的开放阅读框,编码444个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值53.01 ku,理论等电点为7.14.该蛋白的二级结构中,α螺旋占12.44%,β折叠占15.73%,其余71.83%为无规则卷曲.多序列比对分析显示,不同羊痘病毒分离株F10L序列高度保守,一致性在97%以上.此研究结果为进一步研究F10蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础.     

中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据小ＲＮＡ 病毒科（ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ） 中病毒ＲＮＡ 所具有的结构特征, 采用ｍＲＮＡｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒（Ｃｈｉｎｅｓｅｓｃａｂｒｏｏｄ ｖｉｒｕｓ ＣＳＢＶ） 的ＲＮＡ, 并以之为ｃＤＮＡ合成的模板． 依据小ＲＮＡ病毒科中的脊髓灰质炎病毒结构蛋白基因序列设计了一对引物ＶＰ５和ＶＰ３ , 通过ＰＣＲ 扩增获得预期大小约为１ １００ ｂｐ的ＤＮＡ 片段, 将此片段克隆到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上并直接测序． 序列分析表明, 该片段为中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因, 与意蜂幼虫囊状病病毒结构蛋白基因序列的同源性为８６－８ ％ , 与之对应氨基酸序列的同源性高达９３－４ ％ ． 该病毒株为一种新型的蜜蜂囊状幼虫病病毒株     

AC2 and AC4 proteins of <Emphasis Type="Italic">Tomato yellow leaf curl China virus</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Tobacco curly shoot virus</Emphasis> mediate suppression of RNA silencing

Tomato yellow leaf curl China virus Y10 isolate (TYLCCNV-Y10) alone could systemically infect host plants such as Nicotiana benthamiana without symptoms. In contrast, Tobacco curly shoot virus Y35 isolate (TbCSV-Y35) alone induces leaf curl symptoms in N. benthamiana. When inoculated into transgenic N. benthamiana plants expressing GFP gene (line 16c), TYLCCNV-Y10 neither reverses the established GFP silencing nor blocks the onset of GFP silencing. In contrast, TbCSV-Y35 can partially reverse the established GFP silencing and block the onset of GFP silencing in new leaves. In the patch co-infiltration assays, the AC2 and AC4 proteins of TYLCCNV-Y10 and TbCSV-Y35 could suppress local GFP silencing and delay systemic GFP silencing, suggesting that they are suppressors of RNA silencing. Comparison of the accumulation levels of GFP mRNA in the co-infiltration patches showed that Y10 AC2 and Y35 AC2 proteins had similar efficiency for suppression of RNA silencing. However, Y35 AC4 protein functioned as a stronger suppressor of RNA silencing than Y10 AC4 protein. There-fore, the pathogenicity difference between TbCSV-Y35 and TYLCCNV-Y10 may be related to the functional difference in their AC4 proteins.