异硫氰酸酯法固定化醇脱氢酶乳酸脱氢酶和辅酶Ⅰ

本文探索了一条较为简便、实用的制备异硫氰酸酯活性载体的新方法,研究了用异硫氰酸酯共价法固定化醇脱氨酶、乳酸脱氢酶和辅酶Ⅰ的条件,并对三者进行了共固定化。按本实验方法得到的固定化醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活力回收可达8.9%和11.9%,得到的固定化三元全酶系统的辅酶再生能力为相应游离酶系统的4倍。     

磁性聚乙二醇微球固定化辅酶维生素B6的研究

以制备的磁性聚乙二醇胶体粒子为载体，戊二醛为交联剂，固定化辅酶维生素B6，对固定化的条件进行了探索，确定了固定化的最佳条件：室温下，0.03g磁性聚乙二醇微球与5mL(8%)戊二醛交联，固定0.01g辅助酶维生素B6；振荡时间为12小时。     

有效微生物群固定化的初步研究

采用聚乙烯醇作为有效微生物群固定化载体,海藻酸钠为成型助剂,通过聚乙烯醇-硼酸交联法制备固定化细胞,并探讨了固定化有效微生物群的特性.结果表明聚乙烯醇是有效微生物群固定化的良好载体,聚乙烯醇-硼酸交联法制备的固定化细胞呈球状,大小均匀,具有较好的脱氮生物活性、较好的机械稳定性和抗溶剂酸碱度.     

海藻酸钠-壳聚糖固定化漆酶的研究

采用海藻酸钠包埋法和海藻酸钠-壳聚糖包埋-交联法固定化漆酶,探讨了固定化条件、固定化漆酶及游离酶的酶学性质,结果表明：包埋法和包埋-交联法固定化漆酶的最佳条件分别为海藻酸钠浓度3％、CaCl2浓度1．5％和海藻酸钠浓度2％、CaCl2浓度2％、壳聚糖浓度1．5％、戊二醛浓度1％．两种固定化漆酶的最适pH和最适温度相同,分别为5．0和30℃,游离酶pH为4．6,温度20℃．包埋法固定化漆酶、包埋一交联法固定化漆酶和游离酶的米氏常数分别为3．3,2．8,1．22mmol／L．     

离子交换树脂固定接枝脂肪酶

 酶法是制取生物柴油的一种新型方法,而酶的重复利用率直接影响该法的运行成本.本文采用吸附法将碱性脂肪酶L4固定在4种不同树脂上,对比了利用不同树脂和在不同酶液浓度条件下的固定化效果,然后采用吸附-交联法将脂肪酶固定在树脂DK110上,考查交联方式和交联剂浓度对酶固定化的影响以及固定化酶的重复使用稳定性.结果表明：大孔型离子交换树脂DK110的固定化效果最好,酶液浓度对脂肪酶固定化影响显著.交联方式对固定化效果有显著影响,酶液先与戊二醛混合后加入树脂载体(JL1)所获得的酶活最大(340U/g),酶液、戊二醛与树脂载体同时混合(JL2)重复使用稳定性最好.该研究为固定酶法制取生物柴油奠定了基础.     

阴离子交换树脂固定化果胶酶研究

以阴离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂,对果胶酶进行固定化分析,探讨了温度、pH值、时间、加酶量、戊二醛浓度、交联温度、交联时间对果胶酶固定化效果的影响,同时对固定化果胶酶的酶学特性进行研究.结果表明,果胶酶最佳固定化条件为:温度为40℃,pH值为5.5,固定化6 h,加酶量为0.75 mL/g树脂,戊二醛体积分数为0.1%,交联温度为4℃,交联时间4 h.在此条件下,固定化果胶酶的酶活回收率可达到80%以上.酶学特性试验表明,固定化果胶酶最适温度为60℃,最适pH值为4.0,具有较好的操作稳定性.     

棉纤维膜固定化脂肪酶的研究

对棉纤维作载体、对 - ( β-硫酸酯乙砜基 )苯胺 ( SESA)作活化剂固定化脂肪酶的工艺条件进行了研究 ,发现在醚化 p H值为 9.0～ 1 0 .0 ,交联 p H值为 7.0 ,酶的质量浓度为 6 mg· m L- 1,交联时间为 1 2 h,在室温条件下 ,得到最高固定化酶活力为 33U·g- 1。对上述条件下制备的固定化酶的稳定性进行了考察 ,用该固定化酶间歇水解橄榄油 ,重复使用 6次后相对水解率由 1 0 0 %降至 44%。该固定化脂肪酶最适使用的温度为 30～ 35℃ ,p H值为 9.0     

两种不同方法固定化β-葡萄糖苷酶的研究

以自制的壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,考察了壳聚糖浓度对微球制备的影响,并采用吸附-交联法和交联-吸附法两种方法对β-葡萄糖苷酶固定化进行了研究.结果表明:(1)当壳聚糖:2％乙酸溶液=1∶20(w/w)时,最适合制球,成球粒径平均约为1.5mm.(2)采用交联-吸附法时固定率为43％,储存5天后剩余酶活力为67％,10天后剩余酶活力为52％,采用吸附-交联法时固定率为32％,储存5天后剩余酶活力为60％,10天后剩余酶活力为43％.因此,优化的固定化β-葡萄糖苷酶的方法为交联-吸附法.     

甲基丙烯酸-苯乙烯-顺丁烯二酸酐三元共聚物固定葡萄糖淀粉酶

利用自由基沉淀聚合反应合成了不同组成的、具有可逆溶解-沉淀性能的甲基丙烯酸-苯乙烯-顺丁烯二酸酐三元共聚物载体,并测定了其临界pH值(2.47～3.51).利用载体上的酸酐基团固定葡萄糖淀粉酶,得到了具有液相酶和固相酶两者优点的固定化酶.考察了单体组成、固定化反应时间对固定化酶酶活的影响和可回收利用性.固定化酶(湿)酶活可达2 347 u/g,经溶解-沉淀循环3次回收后的固定化酶酶活可保留73%.     

修饰性载体固定化漆酶

采用壳聚糖铜固定化和交联酶聚集体的方法固定化漆酶.探索了固定化前后漆酶的最适温度、pH,热稳定性和金属离子对其活性的影响,交联漆酶聚集体制备的条件.结果为:游离漆酶的最适温度是20℃,最适pH是4.6;壳聚糖铜固定化漆酶的最适温度是25℃,最适pH是4.0;交联漆酶聚集体的最适温度是15℃,最适pH是3.6.固定化后漆酶的热稳定性提高,不同金属离子影响固定化漆酶的活性,其中K+的激活作用尤为明显.制备交联漆酶聚集体最适戊二醛浓度为1%,最适交联时间是2 h.     

盐生杜氏藻和衣藻双结构域NAD+-GPD基因的生物信息学分析

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是极端耐盐的单细胞真核绿藻,依赖于NAD的3－磷酸甘油脱氢酶（NAD+-GPD）是盐生杜氏藻调渗物质——甘油合成的关键酶.盐生杜氏藻NAD+-GPD基因是第一个被发现含双结构域（SerB和GPD）的GPD基因.而双结构域可能是盐生杜氏藻具有极强耐盐性和快速合成甘油的关键.通过与莱茵衣藻基因组数据库比对,发现莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中也存在具有SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因序列.在对两个物种NAD+-GPD基因的基因结构、mRNA组成成分、编码蛋白及其理化性质和编码蛋白结构的分析中,发现二者具有较高的相似性.针对目前仅在盐藻和衣藻中发现含SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因这一现象,分别对SerB和GPD结构域同源基因的系统进化进行了分析.     

重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究

为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。     

生物酶对五氯联苯降解的初步研究

多氯联苯（PCBs）是具有代表性的持久性有机污染物（POPs）,其氯代数目越多,降解越难。本文以分离筛选的6株PCBs降解细菌为材料,制备了含有NADH辅酶再生系统关键酶甲酸脱氢酶（FDH）的PCBs降解复合酶,研究了其对PCBs的降解效果。结果表明,Pseudomonas sp. MGB11胞内酶/FDH复合酶对五氯联苯PCB114的降解率在10 h内可达69.4%,对于高毒性、难降解的高氯PCBs的污染修复具有应用价值。     

嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究

以乙醇产量和细胞密度的提高为目标,从碳源和氮源入手,对嗜热厌氧产乙醇杆菌THermoanaerobacter ethanolicus JW200的培养基作了初步优化以提高乙醇代谢途径中的关键酶的得率,便于提纯.葡萄糖浓度的提高对乙醇的产生有明显的诱导作用,但当葡萄糖浓度高于2%,乙醇产量反而下降.酵母粉对乙醇产量没有促进作用,单纯提高酵母粉浓度对细胞密度无显著影响,而同时提高葡萄糖和酵母粉浓度至2.0%,OD600最高可达2.0.2%葡萄糖,0.5%酵母粉对单位细胞乙醇产量的诱导效果最佳.T.ethanolicusJW200粗酶液中未检测到丙酮酸脱羧酶的活性,经亲和柱Cibacron Blue-3GA部分纯化,在NAD洗脱蛋白中检测到辅酶A依赖型乙醛脱氢酶的活性,表明辅酶A依赖型乙醛脱氢酶是该菌乙醇代谢途径中的关键酶,它和乙醇脱氢酶共同作用,将乙酰辅酶A转化成乙醇.     

反胶束固定化醇脱氢酶的制备

报道了用反胶束体系固定化醇脱氢酶(ADH)的研究.在此体系中,以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为表面活性剂,辛烷和己醇作为溶剂及助溶剂.考察了ADH固定化的影响因素,确立了最佳固定化条件:含水量w0即cH2O/cCTAB为13,酶液pH值为7.8,CATB浓度为0.35 mol/L,己醇浓度为13%.     

树干毕赤氏酵母木糖还原酶Lysine270突变的理性设计

木糖代谢过程中木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的氧化还原不平衡是利用纤维素生成酒精的关键问题之一.前期研究发现Lysine270是形成树干毕赤氏酵母木糖还原酶（P. stipitis XR）与NAD(P)结合口袋的关键氨基酸之一.为研究Lysine270对P. stipitis XR辅酶偏好性的影响,本研究将Lysine270用其它19种氨基酸替代,构建19种不同的XR突变子,利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD(P)之间的相互作用,并从中选择两个突变子K270R和K270N进行试验验证.树干毕赤氏酵母木糖还原酶K270R、K270N突变基因及野生基因WT-XYL1分别在大肠杆菌中进行了表达,表达后的蛋白经His-Tag纯化柱纯化后再进行辅酶偏好性及酶学性质研究.结果发现,Lysine270突变直接影响XR与NAD(P)的Km值,通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH.     

A novel salicylaldehyde dehydrosenase-NahV involved in catabolism of naphthalene from Pseudomonas putida ND6

A novel salicylaldehyde dehydrogenase involved in catabolism of naphthalene from Pseudomonas putida ND6, NahV, has been identified. NahV exhibited lower identity in amino acid sequence with the classic salicylaldehyde dehydrogenase, NahF, from P. putida ND6. This is the first report of an isofunctional enzyme of bacterial salicylaldehyde dehydrogenase. Comparison of Km and Vmax values of NahV and NahF demonstrated that NahF has a more efficient catalytic reaction than NahV, while NahV has much higher affinity for salicylaldehyde and NAD^＋. Both enzymes exhibited broad substrate specificities and catalyzed the oxidation of salicylaldehyde, 5-chlorosalicylaldehyde, formaldehyde, m-nitrobenzaldehyde, o-nitrobenzaldehyde, o-methoxybenxaldehyde, glutaraldehyde, caprylic aldehyde, and glyoxal. However, the relative rates at which the substituted analogs are transformed differ considerably. NahV activity could be enhanced by Fe^2＋, Cu^2＋ and Zn^2＋; whereas NahF activity could only be stimulated by Fe^2＋, NahF is more stable than NahV at elevated temperatures. Dot-blot hybridization analyses showed that nahF-like genes occurred in all naphthalene-degradation bacteria isolated in this study, whereas nahV-like genes were present in only some naphthalene-degrading bacteria.     

A novel salicylaldehyde dehydrogenase-NahV involved in catabolism of naphthalene from Pseudomonas putida ND6

A novel salicylaldehyde dehydrogenase involved in catabolism of naphthalene from Pseudomonas putida ND6, NahV, has been identified. NahV exhibited lower identity in amino acid sequence with the classic salicylaldehyde dehydrogenase, NahF, from P. putida ND6. This is the first report of an isofunctional enzyme of bacterial salicylaldehyde dehydrogenase. Comparison of Km and Vmax values of NahV and NahF demonstrated that NahF has a more efficient catalytic reaction than NahV, while NahV has much higher affinity for salicylaldehyde and NAD . Both enzymes exhibited broad substrate speci- ficities and catalyzed the oxidation of salicylaldehyde, 5-chlorosalicylaldehyde, formaldehyde, m-nitrobenzaldehyde, o-nitrobenzaldehyde, o-methoxybenxaldehyde, glutaraldehyde, caprylic aldehyde, and glyoxal. However, the relative rates at which the substituted analogs are transformed differ considerably. NahV activity could be enhanced by Fe2 , Cu2 and Zn2 ; whereas NahF activity could only be stimulated by Fe2 . NahF is more stable than NahV at elevated temperatures. Dot-blot hybridization analyses showed that nahF-like genes occurred in all naphthalene-degradation bacteria isolated in this study, whereas nahV-like genes were present in only some naphthalene-degrading bacteria.     

1,3-丙二醇脱氢酶三级结构的模建

利用生物大分子数据库及生物信息学技术,对来源于Klebsiella pneumoniae的1,3-丙二醇脱氢酶分子进行二级结构预测、多序列联配．实验发现,其具有较保守的铁离子结合位点,而未发现常见的NAD(H)结合位点．在此基础上,利用同源建模法和穿线法模建该酶的三级结构,进一步发现铁离子结合位点在空间上形成一口袋状结构．探讨对其作用机制,同时发现该序列中存在2个含铁元素的乙醇脱氢酶信号．