鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

all 1691基因表达及铁元素对鱼腥藻生长的影响

为实现FurA的表达,探究铁元素对藻生长的影响,首先运用Primer5.0设计引物,克隆出鱼腥藻PCC7120染色体上all1691(furA)基因片段;构建含组氨酸融合表达标签和T7启动子标签的表达载体.IPTG诱导FurA蛋白表达.然后设计不同Fe3+浓度梯度培养基,利用SDS-PAGE检测高、中、低Fe3+浓度培养液的藻细胞总蛋白,考马斯亮蓝g-250法测定蛋白含量,并用Trizol法提取不同Fe3+浓度培养的藻细胞总RNA.结果表明,获得纯化的all 1691克隆片段,大小为456bp,pET-1691重组蛋白在1mmol/L的IPTG诱导下,于37℃下摇床培养15h得到成功表达;低浓度Fe3+促进藻生长,高浓度Fe3+抑制藻生长;Fe3+浓度为2.0mg/L时rRNA位置与亮度清晰可见,而缺铁培养的藻生长几乎停滞,转录和翻译水平都很低.     

盐藻磷酸果糖激酶DsPFK基因的原核表达及酶活测定

利用原核表达载体pET-32a构建盐藻磷酸果糖激酶DsPFK基因的表达载体pET-32a-DsPFK.转化大肠杆菌BL21(DE3),通过不同温度及不同浓度IPTG诱导后获得以包涵体形式表达的DsPFK重组蛋白,经亲和层析获得大小44.4kDa的纯化蛋白,通过柱上复性的方法测定重组DsPFK蛋白的酶活为950U.     

鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120染色体上与relBE同源的基因asl4561和asl4562表达产物的毒素-抗毒素作用,从鱼腥藻细胞中提取总基因组DNA,设计特异引物PCR扩增目的基因asl4561和asl4562,与T载体连接后经XhoI和EcoR I双酶切并与表达载体pET28a（＋）连接,由IPTG诱导表达,并在IPTG浓度和诱导时间上对asl4561基因的表达条件进行了优化.琼脂糖凝胶电泳显示扩增出了264bp的asl4561基因和213bp的asl4562基因,SDS-PAGE检测表明成功表达出15.65kD和13.55kD的两蛋白,当诱导温度28℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间6h时,asl4561基因表达蛋白在细菌裂解液上清中表达量最大.     

重组E.coli L-天冬酰胺酶的克隆及表达与纯化

以大肠杆菌菌株(E.coli AS 1.357)基因组为模板,PCR扩增L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因(ans B),构建p MD18-Tans B重组克隆载体和p ET-22b-ans B重组表达载体,转化大肠杆菌BL21宿主菌株,重组工程菌经IPTG诱导表达Ans B蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析纯化Ans B蛋白,利用SDS-PAGE定性分析Ans B蛋白,考马斯亮蓝法测定Ans B蛋白含量,获得纯化的质量浓度为62.7 mg/L的Ans B表达蛋白。重组L-天门冬酰胺酶的纯化收率为42.28%,酶活达137 IU/m L,较原始菌株的(6.87 IU/m L)提高近20倍,并排除大肠杆菌自身L-天门冬酰胺酶本底表达背景。     

鱼腥藻PCC7120α质粒上的parD/E同源基因all7155/asl7156的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120质粒上毒素抗毒素系统的蛋白质性质和相互作用,根据NCBI中PCC7120的α质粒上的all7155和asl7156基因数据,通过降落PCR克隆了目的基因(all7155/336 bp,asl7156/258 bp).将目的基因片段连接至p MD18-T构建了克隆载体,蓝白斑筛选了阳性克隆,经双酶切纯化后将目的基因连接至表达载体p ET30a(+),并转入表达菌BL21中,测序后证实构建成功,并利用IPTG诱导进行了表达.通过NCBI的BLAST蛋白比对,发现了all7155和asl7156与已知的Par D/E毒素抗毒素系统同源,可通过对此基因的克隆,表达和蛋白性质来进一步认识Par D/E系统.     

丙型肝炎病毒截短型核心C区和NS_3区融合蛋白(C_8-NS_3)的原核表达

通过RT-PCR从HCV全长基因组中分别克隆HCV核心区和NS3非结构区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达载体pTrcHis2 TOPO TA中,转化大肠杆菌Top10,阳性克隆经IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经15%SDS-PAGE鉴定,重组蛋白经His标签纯化.经IPTG诱导可高效表达分子量约为14.4KD的融合抗原,重组蛋白主要以可溶性形式存在.经过纯化目的蛋白纯度达96.3%以上的,表达量约为550μg/mL.ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

麻疯树小热激蛋白JcHSP-17.5的纯化与活性鉴定

将实验室已有的pET32a-JcHSP17.5重组载体,经测序验证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,不同温度条件下,用不同浓度异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,优化表达条件;选择镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化JcHSP-17.5蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;通过热激聚合反应来鉴定蛋白的分子伴侣活性.结果表明,17℃,200r/min,0.5mM IPTG诱导13h为JcHSP-17.5蛋白的最佳诱导表达条件,使用200mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白后,每500mL菌液可得到1.345mg的电泳纯蛋白,该蛋白在高温(45℃)条件下能够阻止苹果酸脱氢酶(MDH)发生聚合反应,表现出较强的分子伴侣活性.     

毛冠鹿AIF-1原核载体的构建及表达

从毛冠鹿睾丸cDNA文库中筛选出毛冠鹿AIF-1基因,对其进行生物信息学分析,设计引物克隆毛冠鹿AIF-1 cDNA,连入pMD19-T载体,测序正确后酶切,与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,并对可溶性蛋白进行纯化,SDSPAGE电泳,Western Blot分析以及鉴定重组蛋白.结果表明,毛冠鹿AIF-1(TdAIF-1)含有1个438bp的开放阅读框,编码145个氨基酸,经测序和酶切鉴定后,成功构建重组质粒pET-28a(+)-TdAIF-1,表达大小约20 kD的重组蛋白,主要以可溶形式存在,提高洗脱缓冲液中咪唑浓度至50 mmol/L、100 mmol/L能够得到较纯的蛋白.成功构建毛冠鹿AIF-1原核表达体系,获得重组蛋白,为研究AIF-1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

重金属汞和镉对普通小球藻生长的影响

以普通小球藻(Chlorella vulgaris)为研究材料,研究了不同浓度的Hg2+和Cd2+对其生长的影响.结果表明:低浓度(0⁰.50 mg/L)的Hg2+和Cd2+由于毒性兴奋效应能刺激普通小球藻细胞密度的增长,促进叶绿素含量的增加和蛋白质的合成;当Hg2+和Cd2+浓度进一步增加,则抑制普通小球藻的生长;当Hg2+和Cd2+的浓度分别为2 mg/L时,无蛋白积累.     

大气CO2浓度和温度变化对石莼生长及其叶绿素荧光特性的影响

【目的】为了研究大型海藻在全球气候变化背景下的生态功能,探讨大气 CO2浓度升高和温度变化对石莼（Ulva lactuca）生长及其叶绿素荧光特性的影响。【方法】在4种条件（390μL／L CO2＋15℃;700μL／L CO2＋15℃;390μL／L CO2＋25℃;700μL／L CO2＋25℃）下培养石莼,10 d后测定藻体生长、叶绿素荧光参数以及生化组分。【结果】经10℃低温6 h处理,石莼受到光抑制;经35℃高温6 h处理,25℃正常空气条件下生长的石莼表现出较高的最大光量子产量（Fv／Fm）,光能利用效率（α）,非光化学淬灭（NPQ）和光化学淬灭（qP ）,25℃高CO2浓度条件下生长的石莼最大相对电子传递速率（rETRmax）和饱和电子传递速率（Ek ）大于其他生长条件下的石莼;经40℃高温处理6 h,15℃生长的石莼光合机构受损;相对于25℃与正常空气条件下生长的石莼,25℃与高CO2浓度条件下生长的石莼Fv／Fm、a、NPQ和qP 的下降程度较小,而且具有较高的rETRmax 和Ek。【结论】高CO2浓度促进石莼的生长,但其对石莼可溶性蛋白（SP ）、可溶性碳水化合物（SC ）、叶绿素 a （Chl a）和类胡萝卜素（Car ）等生化组分含量影响具有温度依赖性。另外,CO2浓度升高使得石莼抗高温的能力增强。     

铜绿微囊藻叶绿素荧光对HgCl2毒性响应特性的研究

利用叶绿素荧光技术,以铜绿微囊藻在435nm/680nm处的荧光强度为测试指标,进行了铜绿微囊藻叶绿素荧光对Hg2+毒性的最佳响应时间,以及不同Hg2+浓度在短时间内对铜绿微囊藻叶绿素荧光强度的影响研究。研究结果表明,铜绿微囊藻对HgCl2的最佳响应时间为25min。当Hg2+质量浓度为0.000 5mg/L时,铜绿微囊藻的相对荧光强度(样品荧光强度-空白荧光强度)为负值,即其叶绿素荧光强度小于对照组的叶绿素荧光强度;当Hg2+质量浓度为0.001⁰.500mg/L时,铜绿微囊藻的相对荧光强度为正值,并且在0.0010.500mg/L时,铜绿微囊藻的相对荧光强度为正值,并且在0.001⁰.400mg/L浓度范围内,相对荧光强度随汞浓度的增大而增大,其呈正相关关系,r=0.983 3。     

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。     

典型性微量金属元素对藻华的激励趋势探讨

Fe、Mn、Zn等典型性微量营养元素对藻类增殖的影响是探讨藻华成因分析的重要内容.通过设计系列正交实验,研究代表性微量元素Fe、Mn、Zn对常见藻华生物(蓝藻、绿藻)的影响,结果表明:P、Fe、Mn、Zn的质量浓度变化对藻生长速率激励效果明显,显著性顺序依次为:ZnPFeMn.通过单独添加Fe、Mn、Zn的方法进一步进行了藻增长潜力实验.结果表明:在Fe、Mn、Zn质量浓度分别为0.20、0.13、0.033mg/L时,藻类生长速率达到最大值,低于该质量浓度时,金属离子质量浓度与藻类生长速率、生物量呈正相关;高于该质量浓度时,金属离子质量浓度与藻生长水平呈反相关;拟合Fe、Mn、Zn质量浓度与藻生长速率之间的数值关系,分别得到相关系数为0.93、0.87、0.90的回归方程;根据微量元素与藻类生长速率之间的相关性,可以对藻华的爆发时间或程度进行一定精度的预测.正交实验中,锰的激励作用受微量元素之间的竞争性抑制而被消弱,反映出锰的作用机理比较复杂,有待于深入研究.     

表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚对盐藻的毒性研究

以盐藻作为研究对象,研究脂肪醇聚氧乙烯醚（AE）对盐藻的毒性作用。分别使用含有浓度为0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0mg/L AE的营养液培养盐藻,每日记录细胞总数。在实验的第9d,收集藻液并分别对总谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、铜-锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、可溶性蛋白和叶绿素a含量进行测定。结果表明较高浓度的AE对藻类的生长具有一定的抑制作用;不同浓度的AE处理9d后,各处理组盐藻叶绿素a和T-GSH含量没有显著差异;4.0mg/L AE组盐藻可溶性蛋白含量显著低于对照组和0.25mg/L组（p〈0.05）;0.25mg/L组和4.0mg/L组MDA含量显著低于1.0mg/L组（p〈0.05）;2.0mg/L组和4.0mg/L组盐藻H2O2含量显著低于0.25mg/L组和0.5mg/L（p〈0.05）;AE浓度为0.25mg/L和1.0mg/L组盐藻中CuZn-SOD含量显著低于对照组和0.25mg/L组（p〈0.05）,AE浓度4.0mg/L组盐藻中CuZn-SOD含量显著高于与0.25、0.5、1.0mg/L组（p〈0.05）。证实AE对盐藻具有一定的毒性作用,为活化剂AE的合理使用和安全评价提供了理论依据。     

不同种类、浓度的激素配合使用对银斑百里香种子无菌苗生长的影响

以银斑百里香种子为实验材料,研究了不同浓度的萘乙酸（NAA）和2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）与6-苄基氨基嘌呤（6-BA）配合使用对银斑百里香无菌苗生长的影响.结果表明：NAA在0.15 mg/L和2,4-D在0.45 mg/L时是银斑百里香种子萌发成无菌苗的最适宜浓度;MS培养基＋ NAA（0.15 mg/L） ＋6-BA（0.6 mg/L）和MS ＋2,4-D（0.45 mg/L） ＋6-BA（0.6 mg/L）的培养基中银斑百里香无菌苗生长最佳.     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

铁型催化剂对臭氧氧化甲基橙的催化效能

以模拟染料废水甲基橙(MO)溶液为目标物,研究了Fe2+、Fe3+均相催化臭氧氧化及负载型铁氧化物非均相催化臭氧氧化对MO的去除特性,并探讨了在非均相催化剂活性炭负载Fe2O3(Fe2O3/AC)、活性氧化铝负载Fe2O3(Fe2O3/Al2O3)催化臭氧氧化体系中pH值、催化剂投加浓度、臭氧浓度、MO初始浓度等工艺参数的作用规律.结果表明,Fe2+、Fe3+、Fe2O3/AC、Fe2O3/Al2O3的加入均能提高MO的脱色率和COD去除率,且Fe2O3/AC、Fe2O3/Al2O3的催化效果更为显著;当Fe2O3/AC、Fe2O3/Al2O3的投加浓度为1.0 g/L,臭氧浓度为15.0 mg/L,MO初始浓度为25.0 mg/L、pH值为5.0时,30 min时Fe2O3/AC、Fe2O3/Al2O3催化臭氧体系降解MO的脱色率和COD去除率分别为89.26%、48.45%和80.34%、38.41%.