利用改良Nest—tetra—primerspecificPCR技术对两种石斑鱼的鉴别

云纹石斑鱼（Epinephelusmoara）和褐石斑鱼（E．bruneus）为石斑鱼属内近缘种,外形相似常被混淆．本研究改良建立了Nest—tetraprimerspecificPCR方法,获得了云纹石斑鱼和褐石斑鱼线粒体DNAND2基因内的3个特异性条带,分别为内参序列NCl（394bp）、特异性条带ND2-M（268bp）和ND2-B（122bp）,以及核基因组中核糖体DNAITS1区的5个特异性条带,分别为内参序列NC2（588bp）、NC3（563bp）,特异性条带rDNA—M（426bp）、ITS1-M（488bp）和ITS1-B（304bp）．研究结果不仅为两种石斑鱼的鉴别提供了稳定、可靠、快捷的特异性分子标记,而且也为鱼类近缘种的DNA鉴别提供了新的途径．     

赤点石斑鱼ICLP基因的克隆和序列分析

MHC class II invariant chain-like proteins(ICLP)因子与免疫反应密切相关,其参与对抗原的处理,保证多肽不被进一步降解为氨基酸.通过RACE反应获得赤点石斑鱼ICLP2cDNA全序列,全长1 837 bp,包括44 bp的5′UTR区,861 bp的开放阅读框以及932 bp的3′UTR区.编码286个氨基酸,推测的蛋白质分子量为31 878 u.对赤点石斑鱼10个组织的ICLP2基因进行PCR扩增和测序,结果表明赤点石斑鱼ICLP2基因的表达不存在组织特异性.此外,氨基酸序列同源比对的结果表明,赤点石斑鱼与其它16种脊椎动物ICLP2的相似度在25%～78%之间,与狼鲈和鳜鱼ICLP2因子的同源程度最高,分别为78%和74%.根据ICLP的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树,表明了该分子的氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好指标.     

基于rDNA ITS序列的何首乌PCR-RFLP分子鉴别

为建立何首乌(Fallopia multiflora)DNA分子鉴别技术,对何首乌及其常见混淆品的rDNA ITS（核糖体DNA内转录间隔区）序列进行了扩增和测序,运用CLUSTAL X、MEGA软件对该区进行序列分析.结果表明：何首乌与毛脉蓼（F. multiflora var.cilliinervis）、翼蓼（Pteroxygonum giraldii）及耳叶牛皮消（Cynanchum auriculatum）在ITS1区的差异率分别为6.9%、18.1%、42.0%,在ITS2 区的差异率分别为10.0%、19.4%、43.9%,而何首乌种内各居群间ITS1 和ITS2 区的差异分别为0%～2.13% 和0%～1.03%．进一步利用premer premier 5 找出了一个位于ITS2间区的何首乌特征性NsbI酶切位点,将何首乌rDNA ITS 序列PCR扩增产物用NsbI酶切后可得到得一个含约531 bp和109bp的二片段PCR－RFLP图谱, 而其混淆品rDNA ITS 序列PCR扩增产物不能被NsbI酶切,图谱呈单一条带.建立的PCR－RFLP方法简单易行,可用于何首乌原植物的鉴别．     

桑树桑黄与杨树桑黄的分子辨别

为准确鉴别桑黄(Sanghuangporus)近缘种桑树桑黄(S.sanghuang)与杨树桑黄(S.vaninii)、暴马桑黄(S.baumii),本研究基于核糖体基因rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析技术,对桑黄真菌进行了系统发育分析与近缘种的分子辨别研究.结果表明,在NJ系统发育树上,23个桑树桑黄、11个杨树桑黄和6个暴马桑黄菌株各自以很高的Bootstrap支持率聚为了三个独立的分支,种间差异明显.依据桑树桑黄和杨树桑黄的rDNA ITS序列差异,设计两对引物Sv_U1/Sv_L和Sv_U2/Sv_L,均可特异性地扩增杨树桑黄478 bp和651 bp的ITS片段,而不扩增桑树桑黄的ITS片段,因而可用于两个桑黄近缘种的快速分子辨别.本研究为探讨桑黄孔菌属真菌的系统发育关系提供了参考,并为桑黄种间的准确辨别提供了一种有效的分子辅助手段.     

分子标记技术在白木香遗传变异研究中的应用

采用简单重复序列区间扩增(ISSR)技术和核糖体RNA基因(rDNA)转录间隔区(ITS)序列分析技术, 对不同地区白木香的遗传变异、亲缘关系及分子鉴定进行研究. 共筛选出7条ISSR引物, 扩增得到80条带, 其中多态性条带的比率是58.8％. 白木香9个居群之间的遗传距离是0.0733～0.4213, 居群间遗传差异不大; 筛选出的引物IS-8可以进行白木香种内和种间的鉴别. ITS序列在白木香种内的变异很小, 只有6个变异位点, 种内遗传距离为0.0％～1.1％. 根据白木香ITS的序列特征可准确鉴别白木香与近缘种. 两种分子标记方法得到的UPGMA聚类图不一致, 但大致趋势相同, 说明ISSR标记与ITS序列分析均可用于白木香遗传变异及亲缘关系的研究, 但ITS序列分析技术在种内遗传变异研究的分辨力不及ISSR高.     

野山参与园参rDNA-ITS序列比较分析

目的比较野山参与园参rDNA-ITS序列差异,寻找其DNA分子鉴定方法.方法提取野山参与园参总DNA,扩增其ITS序列,运用Clustal X等软件比较分析野山参与园参ITS序列特征.结果野山参与园参经PCR扩增后分别获得700 bp和500 bp两条条带.其中对野山参和园参的700 bp条带测序分析后未发现差异位点,而二者的500 bp条带测序结果相似性仅为38%.结论该结果为野山参的鉴别提供了实验依据.     

赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析

采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1 680bp,含有3′UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5′UTR区,编码区大小为1 074～1 080bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHC IA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC IIB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

高良姜及其混淆品rDNA ITS序列的分析与鉴别

用聚合酶链式反应(PCR)直接测序法测定和分析不同产地野生和农家品种的高良姜及其3种混淆品(山姜、华山姜和大高良姜)的核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列,为高良姜种质资源研究和真伪鉴别提供分子数据.ITS序列分析结果表明:高良姜种内序列同源性达100%,测序结果中发现杂合位点,且广西样品杂合位点的两个碱基所占的比例与其它地方样品的不同.高良姜及其混淆品经测序、比对、排序得到的812bp序列中有61个变异位点,60个是信息位点,同源性达96.32%,其中ITS1和ITS2区中的11个位点在高良姜及其混淆品中差别明显,可以鉴别高良姜及其混淆品.同时发现,基于DNA序列的高良姜及其混淆品的系统分类结果与形态学的分类结果不完全一致,有待进一步研究探讨.     

斜带石斑鱼、赤点石斑鱼RAPD和线粒体Cyt b基因序列变异分析

斜带石斑鱼和赤点石斑鱼为具有重要经济价值的海水鱼类。对这两种石斑鱼进行了随机扩增多态DNA(RAPD)和线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列变异分析。计算多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数,以此评估种内遗传变异水平;通过统计变异位点、平均核苷酸差异数、核苷酸多样性以及种间平均每位点核苷酸替代数进行基因序列变异分析,并构建UPGMA系统树。结果表明:斜带石斑鱼的遗传多样性水平高于赤点石斑鱼,这可能与它们在种内特定遗传结构、分布范围大小、自然资源状况的差异有关;斜带石斑鱼和赤点石斑鱼之间检测到的种特异RAPD条带以及基因序列的变异,可作为种间分子鉴定标记。     

高良姜与混淆品rDNA ITS序列的分析与鉴别

用PCR直接测序法测定和分析不同产地野生和种植品种的高良姜(Alpinia officinarum Hance),以及山姜（A. japonica（Thunb.） Miq.）、华山姜（A. chinensis (Retz.) Rosc.）和大高良姜(A. galanga (L.) Willd )等三种混淆品的rDNA ITS区序列,为高良姜种质资源研究和真伪鉴别提供分子数据。经测序、比对和排序得到812bp序列,包括18S3’端部分序列,ITS1、5.8S、ITS2全部序列和26S5’端部分序列。序列分析结果显示,高良姜种内序列高度一致,同源性达100%,测序结果中发现杂合位点,而广西样品杂合位点的两个碱基各占的比例与其它地方样品的不同,显示了高良姜种内rDNA ITS序列的细微差异。高良姜和混淆品的812bp序列中共有61个变异位点,60个是信息位点,同源性达96.32%,其中ITS1和ITS2中的11个位点在高良姜和混淆品中差别明显,可以鉴别高良姜和混淆品,因此rDNA ITS序列是高良姜真伪辨别的有效标记。基于DNA序列的高良姜和混淆品的系统分类结果与形态学的分类结果不完全一致,有待进一步的研究探讨。     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.     

斜带石斑鱼TLR5S基因结构及功能分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)属于先天免疫系统中的一种模式识别受体(PRR),可分为可溶型和跨膜型2种.它可以识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),从而启动信号转导.本研究从NCBI数据库中得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)可溶型TLR5(ECTLR5S)cDNA全长序列(Genbank登录号:GQ396667).其cDNA序列全长2 439bp,包括69bp的5′UTR,435bp的3′UTR和1 935bp的开放阅读框,共编码644个氨基酸,预测编码蛋白质分子质量为72.28ku,等电点为6.37.将ECTLR5S基因氨基酸序列与其他脊椎动物的TLR5S基因氨基酸序列进行比对,结果显示出很高的相似性,其中与牙鲆相似度可达69%.Real time PCR检测结果显示ECTLR5S基因在斜带石斑鱼不同器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,其次是脾脏、血淋巴、肾脏等.Realtime PCR检测ECTLR5S基因在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染3,6,12,24,48h后的肝脏中表达情况,结果显示ECTLR5S基因在3,6,12,24h时表达量显著上调(p<0.05),而在48h下降至初始水平.这些结果说明ECTLR5S基因可能参与到斜带石斑鱼抗弧菌感染的免疫反应中,并且肝脏是其发挥作用的重要器官.     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

ISSR和ITS标记在白木香遗传变异研究中的应用

采用简单序列重复区间（ISSR）扩增技术和核糖体RNA基因（rDNA）转录间隔区（ITS）序列分析技术,对不同地区白木香的遗传变异、亲缘关系及分子鉴定进行研究.ISSR分析显示,筛选出的7条ISSR引物可扩增出80条DNA条带,其中多态性条带的比例是60.0%,白木香9个居群之间的遗传距离是0.0733-0.4213.ITS序列分析显示,白木香种内的9个居群中共有6个变异位点,种内遗传距离为0.0000-0.0110.两种标记得到的聚类图不一致,但大致趋势相同,都可以将白木香及其近缘种聚在不同的种群中,说明ISSR标记和ITS序列分析均可有效揭示白木香的遗传变异及亲缘关系.     

四指马鲅、多鳞四指马鲅种间差异的DNA条形码分析及SCAR标记开发

在中国海域分布的马鲅科鱼类同属不同种间的外部形态特征极为相似,在形态分类上很容易混淆。本研究采用DNA条形码技术对四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)及其近缘种多鳞四指马鲅(Eleutheronema rhadinum)进行种间遗传差异分析。在检测的线粒体COI基因序列655 bp中,共有变异位点87个,核苷酸多样性为0.132 82,序列同源性为93.34%;基于Kimura 2-parameter模型计算的种间距离为0.151(最小物种距离0.02)。结合Neighbor-joining系统树分析,四指马鲅与多鳞四指马鲅应属于同一个属亲缘关系很近的两个不同种。此外,采用10条随机引物对两种马鲅进行分析,对其中的S4随机引物扩增出约1 300 bp的四指马鲅特异性条带进行SCAR转化,最终获得四指马鲅特异性SCAR标记SCAR1(目的片段469 bp,退火温度62℃)和SCAR5(目的片段606 bp,退火温度56℃),可作为四指马鲅与其近缘物种鉴定的分子标记。本研究可为马鲅鱼类的遗传背景研究和种质资源保护提供技术支撑。     

4种蔷薇珊瑚的核糖体基因ITS的序列分析和分子鉴定

对海南4种蔷薇珊瑚(疑惑蔷薇珊瑚Montipora aenigmatica,壁垒蔷薇珊瑚Montipora circumvallata,单星蔷薇珊瑚Montipora monasteriata和叶状蔷薇珊瑚Montipora foliosa)的核糖体基因ITS的序列进行分析,并和来自Genbank的其他12种蔷薇珊瑚基因ITS序列进行比较,研究其系统发生关系.结果显示:4种蔷薇珊瑚ITS区(ITS1+5.8S+ITS2)长度为535~545 bp,ITS1和ITS2的长度分别为196~202 bp和181~185bp;两两比对显示,ITS区同源性在96.9%~99.1%,其中,ITS1同源性在95%以上,ITS2同源性在94.1%以上;遗传距离在0.002~0.013之间;进化树显示,16种蔷薇珊瑚主要分为乳突型/瘤突型、平滑型/浅窝型2大支,4种海南蔷薇珊瑚都在乳突型/瘤突型分支上,且分子生物学的分类结果与形态分类的结果吻合.研究表明,以核糖体DNA的ITS序列鉴定蔷薇珊瑚属的珊瑚具有一定的可靠性及适用性,它对该属的系统进化研究有着重要的参考价值.     

细叶石斛的位点特异性PCR鉴别

根据细叶石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS 序列,我们设计了位点特异性PCR鉴别引物 XY-JB01S和XY-JB01X,对细叶石斛进行了成功的DNA分子鉴别.在进行位点特异性鉴别PCR之前,首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增,以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度.当退火温度上升为64℃, 只有细叶石斛的模板DNA 能被扩增出来,而其它的37种石斛属植物均为阴性.该鉴别反应重复性好,已在鉴别细叶石斛中发挥重要作用.与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点.     

湘西宏成制药公司不同基地泡桐的分子鉴定

根据核rRNA基因ITS序列、叶绿体trnL-trnF和psbA-trnH序列对湘西宏成制药公司不同基地泡桐进行分子鉴定.用PCR从泡桐基因组DNA中分别扩增出大小约为500bp的ITS序列、540bp的psbA-trnH序列和900bp的trnL-trnF序列.相似性分析结果表明,毛泡桐ITS序列与1号和2号基地泡桐...