Cloning and expression of the vp39 gene ofBombyx mori nuclear polyhedrosis virus inE. coli

The nuclear capsid protein gene (vp39) ofBombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) was amplified successfully by PCR technique and inserted into pGEM 3zf(+). The 5′ and 3′ terminal area of the amplified vp39 gene were sequenced with silver-staining dideoxy method. Bmvp39 gene was sub-cloned into the expression vector pRSET-A, and transformed intoE. coli BL21. This gene was highly expressed by IPTG induction. SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein is about 38 kd, and the expressed amount reached maxium in 4 h with IPTG induction. Supported by the National Natural science Foundation of China and the Doctoral Foundation of Edn carto Committee Liu Deli: born in 1954, Doctoral Candidate from Huazhong Normal University To whom correspondence should be addressed: (027-7882712-2938)     

编码ATR的胞外区基因cDNA的克隆、测序及表达

目的克隆并在大肠杆菌中表达编码炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor,简称ATR)的胞外区基因。方法收集CHO-K1细胞,提取其总RNA,经反转录成单链cDNA,以此为模板PCR扩增出编码ATR胞外区基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后,亚克隆入表达载体pMal-c2x中进行表达。结果利用所设计的引物扩增出完整的编码ATR胞外区基因。以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的39%。结论获得了编码ATR胞外区基因cDNA及其原核表达产物,为进一步研究炭疽毒素致病机理和炭疽病的防治奠定了基础。     

High expression of a rice homeobox inE. coli

Homeotic genes share a characteristic DNA segment, the homeobox, which encodes a defined domain of the homeotic protein-homeodomain which seems to mediate the binding to specific DNA sequences, whereby the homeotic protein exerts a gene regulatory function. In this study, the homeodomain encoded by the OSIH-1 (designated fromOryza sativa-Indica homeobox-1) homeobox of rice was overproduced in a expression vector inE. coli, as a form of inclusion body and analyzed by Western blotting and crossed-immunoreaction. Crossed-immunoreaction studies among OSIH-1, Kn-1 and Quox-1 indicate all three are homologous at the protein level. The OSIH-1 homeodomain is then to identify the homeotic target genes. Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (#39570370) Biography: CHENG Xing-guo (1973-), male, Graduate student.     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

福氏志贺菌ipaC基因的克隆及序列分析

为了克隆福氏志贺氏菌的ipaC基因，以志贺氏菌福氏2a菌株为摸板进行PCR，并将PCR产物插入列pMD-T载体中，得到阳性重组子，并命名为pMD-ipaC．测序结果显示，其核苷酸序列与文献报道的序列有差异，但编码的氨基酸序列相同，表明志贺氏菌的ipaC基因已被成功克隆．     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

葛仙米中SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从葛仙米（Nostoc sphaeroides）总DNA中克隆了一段基因序列,该序列与基因库中已公布的编码普通念珠藻（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为98％,将该基因插入含T7启动子的质粒pET-32a（＋）中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用lmmol／L1PTG诱导表达数小时后,产生较多重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在,SDS-PAGE分析表明：在相对分子量约为22kd的位置有一条明显蛋白质带,将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2550U。     

Cloning and expression of ophc2, a new organphosphorus hydrolase gene

The amino acid sequences of N-terminal and internal peptide of OPHC2, purified from Pseudomonas pseudoalcaligenes strain C2-1 in our lab, are determined. The full-length organphosphorus hydrolase gene ophc2 is cloned by PCR using the degenerate primers designed according to the sequences and future inverse PCR. The ophc2 gene is 975 bp long with G C content of 63%, comprising one open reading frame encoding a polypeptide of 324 amino acids with a molecular weight of 36 kD. The nucleotide sequence of ophc2 shows low homologies with those organphosphorus hydrolase genes deposited in GenBank, one of which exhibits the highest homology of 46.4% with ophc2. The organphosphorus hydrolase protein expressed in E. coli bears normal bioactivity.     

Cloning, sequencing and phylogenic analysis of duck prion gene

Duck prion gene was cloned and sequenced. Similar to mammalian prion protein (PrP), duck prion is encoded by a single exon of a single copy in genome, which was confirmed by Southern blot analysis. All of the structural features of mammalian PrP were also identified in the duck PrP. Compared with mammalian PrP, it exhibited a 30 % of general similarity. When compared with chicken PrP, it showed a higher homology of 97%. A phylogenetic tree was constructed to trace evolution of prion gene in animals.     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

水貂朊蛋白前体基因的原核表达

 构建了水貂朊蛋白前体基因的表达载体,所筛选出的阳性克隆质粒经转化表达菌BL21(DE3)后,收获表达菌,纯化鉴定表明获得了目的产物.     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从一株短小芽孢杆菌H9克隆了编码葡聚糖内切酶的基因（该序列已经被已收录于GeneBank,登录号为EF620915）,序列分析表明该基因读码框为1980bp,编码659个氨基酸。预测的酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,第二个结构域为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成。将基因构建在大肠杆菌表达载体pET20b中得到重组质粒pET20b-EglA,将重组载体转化至大肠菌株BL21(DE3)菌株,基因在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达, SDS-电泳图谱表明酶的分子大小约为73KD。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因克隆及表达分析

[目的]唐古特白刺(Nitraria tangutorum)是土壤荒漠化和盐碱化防治的先锋植物,对高盐和干旱有极强的适应能力,植物CBL基因作为钙离子感受器,在植物逆境应答及发育过程中具有重要功能.以盐生植物唐古特白刺为材料,开展唐古特白刺CBL基因克隆及表达分析,以深入了解唐古特白刺的抗逆分子机制.[方法]根据唐古特...     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

人胰岛素A链与B链基因的化学合成,克隆与表达

采用大肠杆菌密码子，用化学法分别合成人胰岛素２１个氨基酸的Ａ链，３０个氨基酸的Ｂ链，并在基因的５端引入甲硫氨酸密码子，尾部加入终止密码，两端加入限制性内切酶，Ａ链为８３个核苷酸，Ｂ链为１１０个核苷酸，经纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接反应后，分别克隆了人胰岛素Ａ、Ｂ链基因，然后选用ＰＬ启动子，构建了以牛生长前１３４个氨基酸的大片段基因，分别与人胰岛素Ａ链、Ｂ链基因的融合基因的融合基因的表达质粒ＰＬＷ     

杉木ClWRKY44基因克隆及其表达特性分析

【目的】以杉木幼叶为试验材料,通过克隆杉木ClWRKY44基因,分析其表达特性,为揭示杉木抗逆生理的分子机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR技术克隆杉木ClWRKY44 基因,对其进行生物信息学分析和亚细胞定位研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。【结果】杉木ClWRKY44 基因的开放阅读框(ORF)为1 776 bp,编码591个氨基酸,具有WRKY结构域。系统进化树分析结果显示ClWRKY44 基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATWRKY44 的亲缘关系较密切,其在杉木的不同器官(叶、根、茎) 中均有表达,嫩叶中的表达量最高,茎中次之,根中最低。低温胁迫处理6 h,ClWRKY44 基因相对表达量最高,约是对照组的79.8倍。干旱胁迫处理24 h,ClWRKY44 基因在高浓度干旱胁迫处理下的相对表达量最高,约是对照组的46.6倍。【结论】杉木ClWRKY44基因编码的蛋白质序列与拟南芥ATWRKY44的同源性很高,在调控植物逆境胁迫应答过程中可以发挥功能,为杉木幼苗生长发育的适应性提供参考。