短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的性质

对短小芽孢杆菌ｃ１７２（ｐＢＸ９６）转化子发酵淀粉产生的碱性蛋白酶,采用硫酸铵沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５脱盐、ＤＥＡＥ－纤维素柱层析等方法进行纯化,并对纯化酶的性质进行了研究．结果表明,酶反应的最适ｐＨ值为１１．０;在ｐＨ８．０～１１．０之间稳定;最适反应温度为４０℃;热稳定性较好,４５℃下处理３０ｍｉｎ酶活性不变,６０℃下处理３０ｍｉｎ活力保留６５％．对甲基苯磺酰氟（ＰＭＳＦ）能完全抑制该酶活性,洗涤剂中的三聚磷酸钠对酶有较大钝化作用．     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ转化枯草杆菌的研究

本文采用我国自己分离的短小芽孢杆菌抗四环素质粒pCJ3转化枯草杆菌的各种突变体.质粒DNA经氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化后转化枯草杆菌的感受态细胞.结果表明枯草杆菌BR151,SB202,168,QB1130及QB1133都可作为质粒pCJ3的受体,转化效率在10~3左右,其中以SB202这株突变体为最高,从各种转化体中提取的质粒及经BamHI消化后的质粒的电泳图均与原质粒pCJ3及其BamHI酶切片段相同,并具有pCJ3的抗四环素转化活性.将pCJ3DNA经BamHI酶切后重新用T_4-DNA连接酶连接再转化枯草杆菌细胞,其转化效率比原质粒高1—2个数量级.研究了二价金属离子、pH及培养基成分对转化的影响,结果证明:Ca~(++)对枯草杆菌转化有促进作用,Cu~(++),Zn~(++)则有抑制作用,转化的最适pH在7.2—7.5之间;营养丰富培养能提高转化效率.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)X93胞外产物对病原弧菌抑制效果的研究

采用平板扩散法对从健康大黄鱼肠道中分离筛选到的对病原弧菌有抑制作用的短小芽孢杆菌(Bacillus pumi-lus)X93胞外产物(Extracellular products,ECP)作用的环境影响因子进行了研究。结果显示,菌株X93胞外产物的抑菌活性强弱随着培养时间的不同而不同,胞外产物对pH条件有一定的耐受性,对热敏感,不耐高温,过高的NaCl能使其抑菌活性降低,蛋白酶K和不同浓度的FeCl3均对其抑菌活性产生影响,其胞外产物发挥最大抑菌作用的最适培养时间、温度、pH、盐度分别为48 h、28℃、pH 7和0.5%。     

不同流加策略对内生真菌拟茎点霉生产去乙酰真菌环氧乙酯的影响

去乙酰真菌环氧乙酯是红树林内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)的次级代谢产物,为罕见的去乙酰真菌环氧二烯类化合物,结构十分新颖,具有较好的抗肿瘤活性.本实验以诱变后获得的拟茎点霉A818为出发菌株,采用发酵罐对拟茎点霉A818进行培养,考察了不同发酵策略对去乙酰真菌环氧乙酯积累的影响,获得了适合去乙酰真菌环氧乙酯发酵生产的流加策略.与间歇培养相比,分别流加麦芽糖和马铃薯煮汁均能显著提高去乙酰真菌环氧乙酯的积累量,而且将糖质量浓度控制在30～40 g/L利于去乙酰真菌环氧乙酯的积累.实验最终确定的发酵策略为:前期恒速流加马铃薯煮汁同时变速流加麦芽糖,并控制糖质量浓度在30～40 g/L的联合流加方式.采用该发酵策略对拟茎点霉A818进行发酵,最终去乙酰真菌环氧乙酯质量浓度达到184.0 mg/L,为间歇发酵的4.64倍.     

短小芽孢杆菌BA06的比较基因组分析

将短小芽孢杆菌BA06与其他18个短小芽孢杆菌菌株进行全基因组比较,鉴定出BA06基因组中有包括抗性岛、毒力岛、共生岛在内的12个基因组岛或噬菌体序列.基因家族分析鉴定出BA06有3个特异性基因家族,9个基因家族发生扩张,3个基因家族有所收缩.表明BA06在短小芽孢杆菌这一菌种中具有突出的抗药性与运动能力,并具有除皮革脱毛外更多的生物学特性.     

中成药中短小芽孢杆菌对γ射线敏感性研究

通过对3种剂型中成药中短小芽孢杆菌的存活数与辐照剂量关系的研究,建立了3种剂型中成药中短小芽孢杆菌的存活数与辐照剂量的数学模型,确定了3种剂型中成药中短小芽孢杆菌的D10值,并对影响辐照灭菌剂量的因素进行了讨论.结果表明:3种剂型中成药中短小芽孢杆菌对γ射线敏感性不同,小活络丸中短小芽孢杆菌对γ射线敏感性较高,鼻炎片中短小芽孢杆菌对γ射线敏感性次之,松刚益肝丹中短小芽孢杆菌对γ射线敏感性较低.     

拟茎点霉全局性调控因子veA基因的克隆及鉴定

克隆及鉴定了1株抗肿瘤聚酮去乙酰基真菌环氧二烯(DAM)高产菌株拟茎点霉G818的全局性调控因子veA基因.根据已发现的VeA同源蛋白序列,选取N端保守区域设计简并引物,利用常规PCR及LA-PCR技术获得veA基因序列,然后结合Softberry软件和NCBI数据库分析确定出veA基因的ORF.克隆得到的veA基因,存在1个大小为64 bp的内含子,能够编码381个氨基酸.veA基因的成功克隆为后续RNA干扰菌株的构建及VeA在DAM的生物合成过程中所起作用的探究奠定基础.     

短小芽孢杆菌TY079产抗菌物质的发酵培养基研究

在摇瓶培养条件下,采用单因素与正交试验相结合的方法,对影响短小芽孢杆菌TY079产抗菌物质发酵培养基的主要成分进行优化,得到最佳培养基为：葡萄糖0.5%、玉米粉0.5%、蛋白胨1.5%、豆饼粉0.5%、KH2PO40.75%、MgSO4.7H2O 0.2%,优化后抑菌圈直径是优化前的1.42倍。     

Cloning and Characterization of Gene Promoters from Bacillus pumilus

DNA fragments obtained from Sau3AI partially digested total DNA of Bacillus pumilus UN31-C-42 are first inserted into BamHI site of pSUPV4, a promoter-probe vector. The recombinant DNA molecules are transformed into Escherichia coli cells and eight-three Kanr clones (named pSUBp1-pSUBp83) are obtained. The inserted fragments in pSUBp53, pSUBp57, pSUBp21, which showed high level of kanamycin- resistance, are sequenced and analyzed, respectively. These fragments contain some con-served sequences of prokaryotic gene promoters, such as TATAAT and TIGACA box. The promoter frag-ment Bp53 could efficiently promote the alkaline protease gene of B. pumilus expression not only in E.coli but also in B. subtilis cells.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用

短小芽孢杆菌SCU11产生的胞外碱性蛋白酶具有良好的生皮脱毛效果,在生物制革领域有很大的应用前景.但该菌株的遗传转化系统尚未建立起来,限制了菌株的遗传改造和基因功能研究等方面的工作.本研究采用高渗透压电转化法,实现了对短小芽孢杆菌的电转化;在Ebuffer配方为甘露醇1M,山梨醇0.5M,甜菜碱7.5%,甘油10%,电场强度24KV/cm条件下,转化效率为3.5×10~3 CFU/μg DNA.构建了E.coli-Bacillus穿梭载体pUCETs,建立了短小芽孢杆菌基因敲除体系,利用该系统成功敲除了基因组中的peptidaseC40基因.本研究所建立的电转化系统及基因导入/敲除体系,为短小芽孢杆菌基因组编辑奠定了基础.     

降解苯并[a]芘的Bacillus pumilus strain Bap 9菌株的分离、鉴定与降解特性

从长期受烧烤影响的土壤中,分离筛选出一株能利用苯并[a]芘作为唯一碳源和能源的高效降解菌Bap9,通过16S rRNA基因序列分析和部分生理生化特征分析,鉴定为Bacillus pumilus.摇瓶试验结果表明,菌株Bap9能在20d内将40mg/L的苯并[a]芘降解27.3%.通过对OD600和苯并[a]芘残留浓度的检测分析,考察了pH值、接种量和装液量对菌株生长和降解性能的影响.结果表明,菌株在pH值为6.0—9.0的条件下均能生长并能降解苯并[a]芘,降解的最适pH值为8.0,最佳接种量为5%,最佳装液量为10ml/50ml.     

短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

为了实现对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SCU11基因组连续地无痕改造,提高碱性蛋白酶产量,本文建立了基于Upp基因反向筛选的短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统,将碱性蛋白酶基因AprE的1份拷贝无痕插入至短小芽孢杆菌染色体16S rDNA区.摇瓶发酵实验显示,突变菌株碱性蛋白酶活最高达到7125 U/mL,与出发菌株相比提高了33.1%.结果表明利用该系统可实现对短小芽孢杆菌基因组的无痕修饰,对AprE插入突变菌株进行双交换筛选的最终效率约为23.07%.     

短小芽孢杆菌JK-SX001非蛋白抗菌物质研究

为探讨短小芽孢杆菌JK-SX001菌株非蛋白抗菌物质对杨树溃疡病的作用机制,研究了该菌株非蛋白抗菌物质的提取方法及抗菌物质对金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospora)和七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)真菌菌丝及分生孢子的抑制机制,同时对其部分理化性质进行了测定。结果表明,JK-SX001菌株产生的非蛋白抗菌物质能强烈抑制病原真菌菌丝生长和分生孢子萌发,且能使分生孢子溶解。光照、温度对抗菌物质影响较小,而有效存储期对抗菌物质影响相对较大。