转录因子AP-2α与ACTN1、TES的相互作用

AP-2α是转录因子AP-2家族中的重要一员,与发育和细胞生长、分化和凋亡都有密切的联系.本文用酵母双杂交的方法筛选得到两个与转录因子AP-2α相互作用的蛋白,经测序鉴定分别为ACTN1与TES基因.在先前对AP-2α与TES基因分别克隆并在表达的基础上,进一步克隆并表达了ACTN1基因,并证实了ACTN1蛋白与AP-2α能够在体外相互作用.而且免疫共沉淀的结果表明在HeLa细胞系中过表达的AP-2α与TES蛋白能够处于同一复合体中.同时发现HeLa细胞系中,内源表达的ACTN1蛋白与GFP-TES有明显的共定位.结果提示这3种蛋白可能存在于同一个大的复合体中,通过这样的结合完成复杂的调节功能.     

人类基因ZNF569结构域在MAPK信号途径中的作用

有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径是细胞信号转导过程的重要组成部分，MAPK将膜转导蛋白与其细胞内的关键调控靶蛋白联系起来，从而介导胞外的多种信号并将这些信号级联放大后传递给相应的下游因子，通过激活包括SRE，ELK-1，AP-1等在内的多种转录因子，最终开启细胞特定功能基因的表达，锌指蛋白是人类最大的基因家族之一，其蛋白产物主要通过与DNA相互作用而起转录因子作用，调节靶基因的表达以适应生物体发育、分化、成熟过程的需要，运用MAPK信号途径对锌指基因ZNF569的结构域进行了转录活性分析，分析表明在COS-7细胞中过表达ZNF569蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子AP-1和SRE的转录抑制活性显著下降，ZNF569在核质内的亚细胞定位分析进一步证明了其作为转录因子的作用，对ZNF569的分段report assays分析表明，ZNF569可能通过KRAB框和C2H2锌指结构域行使其抑制转录的作用，这些结果表明，ZNF569可以通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程。     

植物种子发育过程中关键转录因子的研究进展

种子是高等植物所特有的生殖器官，是人类获取脂质和蛋白质的主要来源．种子发育过程主要分为胚胎形态发生和种子成熟2个阶段，此过程受到严格的时空调控，由诸多转录因子构成的复杂调控网络调控该过程，如HAP3家族、B3家族、MADS-BOX家族、AP2家族、PcG家族、Dof家族等的转录因子均在种子发育的多个途径中调控基因的表达．对这些在种子发育中起重要的调控作用的关键转录因子以及它们之间的蛋白互作调控网络进行阐述，以期为今后该类转录因子的挖掘和利用提供新思路．     

一个人类锌指蛋白家族新基因ZFP28的克隆及表达

Krupple型锌指蛋白是一类具有重要功能的转录调节因子，初步克隆了一个新的人类krupple型锌指蛋白基因，经国际基因命我委员会批准命名为ZFP28。此基因长4076个碱基，含8个外显子，在基因组DNA上长18kb。它编码的蛋白质全长868个氨基酸，含1个信号肽，2个KRAB框和14个C2H2型的锌指。Northem Bolt分析表明该基因在人类早期胚胎的各个组织中普遍表达，在肺和肝中的表达水平最强，其结构和表达特征预示着它编码的是一个具DNA结合功能的转录调控因子。     

TNFAIP1基因通过抑制Bcl-2的表达诱导细胞凋亡

将TNFAIP1基因成功克隆到真核表达载体pCMV—Myc中,研究TNFAIP1基因诱导细胞凋亡的机制．Hochest33258和流式细胞计数实验发现,过表达TNFAIP1能够诱导HeLa细胞凋亡．通过对凋亡相关基因的研究,发现过表达TNFAIP1能够抑制Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达,推测TNFAIP1基因可能通过抑制Bcl-2的表达诱导细胞凋亡．     

斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析

为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western blotting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627 bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;IPTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49 000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.     

转录因子HIF-1研究进展

缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是细胞处于低氧及模拟低氧环境条件下产生的一种蛋白转录调控因子.通常HIF-1由α和β2种亚基组成,α亚基是活性亚基,β亚基推测与稳定性和活性构象转变有关.HIF-1参与多个信号转导通路,与细胞低氧诱导应答关系密切,调控低氧环境引起的一系列基因的表达.主要针对HIF-1的结构、靶基因和功能等方面进行综述.结果表明,HIF-1编码多种靶基因,在血管生成、脂肪发育以及肿瘤生长等诸多方而起着至关重要的作用.     

E2F3基因原核表达载体的构建

为研究E2F3转录因子的结构、功能及其与肿瘤发生的联系,从人组织中克隆E2F3基因,通过巢氏PCR和桥联PCR成功构建了E2F3的原核表达载体,实现了对E2F3基因的原核表达,并用Western检测了重组蛋白。研究中发现E2F3cDNA编码序列中含有一段富含GC的区域,该区域对E2F3基因的PCR扩增影响很大。     

新基因ZNF325在人类早期胚胎中的表达

锌指蛋白基因家族是人类最大的基因家族之一，目前已知的很多转录调控因子都是锌指蛋白成员^[1]。初步克隆了一个与RBAK基因有着高度同源性的人类C2H2型锌指蛋白新基因，经国际基因命名委员会批准命名为ZNF325，此基因位于染色体7p22，长2697个碱基，含5个外显子，在基因组DNA上长15kb。它编码的蛋白质全长462个氨基酸，含15个C2H2型的锌指。Northern Bolt分析表明该基因在人类早期胚胎的各个组织中普遍表达，在肺和脑中的表达水平最强，但在肝中的表达随着胚胎的发育而逐渐减少。它的结构和表达特征预示着它编码的是一个具DNA结合功能的转录调控因子。     

斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备

pitx2基因是一类bieoid相关的同源异型框因子成员,介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化.pitx2基因位于Nodal信号途径的下游,直接由Nodal信号分子控制.用PCR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区,并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pGEX-4T-1-pitx2)转入B121感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白.用GST珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体.获得了pitx2原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗pitx2多克隆抗体.提取斑马鱼不同器官和组织蛋白,用自制的多克隆抗体检测pitx2基因在斑马鱼中的表达情况,发现pitx2基因特异性地在心脏、脑、肌肉、小肠和肝脏表达,尤其在心脏中有很高的表达,表明制备的抗体特异性非常好.     

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

克隆了一个新的人类Lish/CTLH结构域基因,经国际基因命名委员会批准命名为RMND5A.该基因位于染色体2p11.2,长3 239 bp,编码391个氨基酸,其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA.RT-PCR分析表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达,在心脏、肝和肾中的表达水平较强.对该基因的蛋白进行了表达并制备了多克隆抗体.荧光素酶活性测定分析表明,在COS7细胞中过表达蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和AP-1的转录活性显著下降,表明RMND5A通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.     

果蝇Mef2基因多克隆抗体的制备及检测

为了在果蝇模型中进一步研究Mef2基因的功能,制备了Mef2多克隆抗体.以果蝇cDNA文库为模板,PCR扩增出亲水性和特异性均好的果蝇Mef2基因片段,将其克隆入pET-28a原核表达载体,然后将重组质粒转化入大肠杆菌菌株Rossetea,用IPTG诱导表达融合蛋白.融合蛋白先经Ni-IDA凝胶柱纯化,再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,然后用不同浓度的抗体分别进行Western-blot实验检测抗体效价.所得结果显示获得了较高效价的果蝇Mef2多克隆抗体.     

TNFAIP1与RIN3相互作用的鉴定

TNFAIPI是第一个被鉴定能受TNF-α(tumor necrosis factor-α)诱导的蛋白.TNFAIP1基因是一个多功能基因,参与DNA的复制和修复,细胞周期的调控,细胞信号通路转导的调节等.采用酵母双杂交的方法以TN-FAIP1为靶蛋白筛选得到与其相互作用蛋白RIN3.RIN3含有RIN家族多个多功能的结构域,根据RIN3结构域对其分段,研究与TNFAIPI的相互作用.通过免疫共沉淀,荧光共定位一系列细胞证明TNFAIP1蛋白能直接与RIN3相互作用,提示TNFMP1可能参与细胞的胞吞胞吐.     

3个拟南芥紫色酸性磷酸酶基因的cDNA克隆及体外表达

根据拟南芥基因组测序结果，用RT-PCR的方法，克隆到3个可能的紫色酸性磷酸酶cDNA的序列(At-PAP20，AtPAP21，AtPAP22)，半定量PCR的结果表明，3个PAPs在细胞中都是组成型表达的,把PAPs的0RF分别与荧光蛋白基因序列和组氨酸标签融合，并在昆虫细胞表达系统中得到表达，荧光信号分布在细胞质中，显示这3个基因的产物在细胞质中发挥作用。     

Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备

Pericardin 基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin 基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogal actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot 检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin 多克隆抗体,为Pericardin 功能的进一步研究奠定了基础.     

人类新基因ZNF322的研究进展

根据计算机克隆的ZNF322基因序列设计引物,从人类胚胎心脏文库中克隆了ZNF322基因.该基因位于染色体6p22.1,编码由402个氨基酸残基组成、含有9个连续排列的C2H2型锌指蛋白质.Northern杂交的结果表明该基因在成人所有被检测组织中表达。亚细胞定位研究证明ZNF322蛋白分布在胞核和胞质中.报告基因分析显示ZNF322是一种潜在的转录激活因子.     

建立可诱导表达TNFAIP1的稳定细胞系

利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞系,扩大培养后在荧光显微镜下观察克隆的诱导效率,得到了低背景,高效诱导表达GFP-TNFAIP1的稳定细胞系,便于研究TNFAIP1在细胞生长、细胞周期和细胞信号通路等方面的作用.     

在心脏组织表达的一个人类新基因

KRAB／C2H2型锌指蛋白是一类具有重要功能的转录调节因子，初步克隆了一个新的人类KRAB／C2H2型锌指蛋白基因，经国际基因命名委员会批准命名为ZNF382，此基因长2824bp，含5个外显子，4个内含子，在基因组DNA上长约23kb，它编码548个氨基酸，在氮末端含一个KRAB框，碳末端含一个未成形的锌指(VZF)和9个锌指(ZF)，Northern杂交结果表明，ZNF382mRNA在早期胚胎时期(至少在妊娠34d之前)就开始表达，在不同时期人类胚胎组织中广泛表达，包括小脑、肾、大脑、肺、心脏、骨骼肌、舌和肾上腺，在成人组织其表达限制在心脏，其结构和表达特征预示着ZNF382在心脏发育和功能的发挥起着潜在的作用。     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

Src真核表达载体的构建与表达

构建酪氨酸蛋白激酶Src真核表达载体,并检测其在HEK293T细胞中的表达.根据Genebank（GI：4574718）提供的大鼠Src的cDNA序列设计特异性引物,以大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Src的目的基因,然后克隆至真核表达载体pcDNA3.1.将筛选的阳性重组子转染入HEK293T细胞系,免疫印迹检测Src的蛋白表达水平,经限制性内切酶双酶切及测序分析,扩增的Src的cDNA成功连接入pcDNA3.1,并且序列与Genebank中一致.免疫印迹结果表明,构建的Src-pcDNA3.1可在HEK293T细胞中表达.成功构建了Src-pcDNA3.1真核表达载体,并且可在HEK293T细胞中高效表达.