感染番茄抗病品种的番茄黄化曲叶病毒的基因变异分析

近几年来,生产中发现一些番茄抗病品种在不同环境条件下或应用几年后出现感病现象。为了解不同抗病品种中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)基因变异的情况,对5个感染TYLCV的番茄抗病品种进行了TYLCV全长基因克隆和序列测定。扩增结果显示,5个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781 bp,且均编码6个功能蛋白。基因组序列比较发现,这5个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到99%以上;通过功能蛋白比对发现,复制增强因子AC3蛋白存在变异,同世界各地报道的TYLCV-Israel株系典型分离物的AC3蛋白存在7处氨基酸差异的位点。分析结果表明,这五个病毒分离物均属于TYLCV-Israel株系,其AC3蛋白的氨基酸序列变异程度均不显著,并没有产生新的病毒株系。     

侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT—PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RTPCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2（BBWV2）基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNAl和RNA2具有高的序列同源性,分别为76．6％～94％和76．9％～94．1％,而与BBWVl的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种（品系）加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53．3％,并且供试20品种（品系）均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。     

番茄黄化曲叶病毒病抗性材料的筛选鉴定

 为评估新培育番茄栽培品种对番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的抗性水平,更全面地了解这些品种的抗病性差异,以金棚1 号和金曼为感病对照,采用带毒烟粉虱自然传毒方式,对各品种的发病时间、发病率及病情指数等参数进行比较,结合PCR 及ELISA 对TYLCV 的检测结果,综合分析了18 个番茄品种对番茄黄化曲叶病毒的抗病性。结果表明,不同品种对TYLCV 的抗性差异较大。金棚1 号和金曼两份材料发病率都达到100%,病情指数在65.2 以上,属于典型的感病品种;秋光15-6、PC-88 和秋光69 号3 份材料发病率和病情指数均为0,属于抗性较高的品种;其他13 份材料的发病率和病情指数分别在5.6％～45.2%和2.6～18.0 之间,分别表现了不同程度的抗、耐病水平。     

番茄属(Lycopersicon)RAPD标记遗传分析

用26条随机引物（10bp)对番茄属9个种的43份材料进行了RAPD分析，共检测到199个位点（稳定的带），平均每条引物检测到7．65个位点；其中多态位点为146个，占总扩增位点数的73．37％；依此将番茄属43份材料划分为4个类群；供试材料间平均遗传距离介于0．041－0．452之间。     

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1，R1)，扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理，巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物，使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列，又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分；另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对，从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列，还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增，避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程，优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4，R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。     

加工番茄籽碰撞接触恢复系数的试验

为建立加工番茄籽在加工番茄籽清选装置及排种器中的碰撞接触模型,结合恢复系数的基本定义,采用FASTCAM-10K系列Model 500高速摄像机、自制跌落仪及PC机构建了加工番茄籽恢复系数测试装置,对加工番茄籽的弹性特性进行了测定.试验选择目前新疆广泛种植的加工番茄品种"里格尔87-5"的种子进行研究,采用L12(31×24)混合正交试验研究各相关因素对加工番茄籽恢复系数的影响,结果表明:影响加工番茄籽法、切向恢复系数的显著影响因素为碰撞材料、下落高度和材料厚度.采用L4(23)回归正交组合试验建立了下落高度和材料厚度与法、切向恢复系数的二元线性回归模型.     

感染番茄抗病品种的番茄黄化曲叶病毒的基因变异

近几年来,生产中发现一些番茄抗病品种在不同环境条件下或应用几年后出现感病现象。为了解不同抗病品种中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)基因变异的情况,对5个感染TYLCV的番茄抗病品种进行了TYLCV全长基因克隆和序列测定。扩增结果显示,5个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781 bp,且均编码6个功能蛋白。基因组序列比较发现,这5个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到99%以上;通过功能蛋白比对发现,复制增强因子AC3蛋白存在变异,同世界各地报道的TYLCV-Israel株系典型分离物的AC3蛋白存在7处氨基酸差异的位点。分析结果表明,这五个病毒分离物均属于TYLCV-Israel株系,其AC3蛋白的氨基酸序列变异程度均不显著,并没有产生新的病毒株系。     

新品种石红206加工番茄示范及栽培技术

<正>由于加工番茄主栽品种“里格尔87-5”品种的退化,加工番茄的单产和品质受到一定的影响。为了     

番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.     

合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础     

膜下滴灌加工番茄田间小气候的特征

以里格尔87-5番茄为材料,研究了膜下滴灌与沟灌两种方式的田间小气候特征,结果表明：滴灌番茄生育前期提高土壤温度,旺盛生育期有降温效应,保持土壤湿度,防止灌溉水渗漏,光照强度和光合速率优于沟灌,明显改善了番茄生育期的生态小气候条件。     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1E基因的5′端克隆及部分序列分析

根据国外报道的 JEV( Japanese encephalitis virus)基因组全序列 ,针对 JEV E基因 5′端设计合成一对特异引物 ,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA为模板 ,经 RT-PCR扩增 ,获得 366bp的 JEV E基因 c DNA片段 .将此片段重组于质粒 p UC1 9中 ,并转化大肠杆菌DH5α.经 PCR扩增 ,酶切及序列分析 ,结果表明 JEV M73-1 5′端 1 2 6个核苷酸序列与 JEV日本 Nakayama株和 Ja OAr S982株的同源性分别为 96.8%和 96.8% ,氨基酸序列同源性均为 99.2 % .通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了 1 973年在呼和浩特市流行的脑炎是由 JEV引起的流乙脑炎 .E基因编码 JEV的囊膜糖蛋白 ,是其重要表面抗原 .JEV M73-1 E基因 5′端克隆和部分序列分析对 JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值     

番茄耐冷性RAPD分子标记的筛选及特异片段的克隆

以番茄耐冷性近等基因系为试材,从耐冷及冷敏感植株中提取DNA构建耐冷DNA池及冷敏感DNA池,采用RAPD技术,从280个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物OPF14,用轮回亲本及回交后代的单株DNA进行验证,证明了该引物扩增出的特异性片段是一个与番茄耐冷性相连锁的RAPD标记.从琼脂糖凝胶回收OPF14扩增出的多态性条带与载体pGEMR-T-Easy连接,并转入大肠杆菌DH5-a,对克隆片段测序表明实际大小为792bp,这为转化成稳定的SCAR标记奠定了基础.     

番茄紫外损伤DNA结合蛋白2(UV-DDB2)全长cDNA克隆及RNAi载体的构建和转化

人类紫外损伤DNA结合蛋白复合体(UV-DDB)由127 kDa 的DDB1蛋白和48 kDa的DDB2蛋白组成.DDB复合体在核酸损伤修复(NER)过程中起到重要作用.本研究通过RACE技术,获得番茄DDB2的全长cDNA序列(1945 bp),具有一个完整的开放阅读框(160bp),编码的氨基酸序列与拟南芥和水稻的DDB2蛋白分别有65.5%和56.1%同源性.利用半定量RT-PCR技术分析表明,DDB2在番茄根、花、嫩叶和幼嫩的果实等分裂旺盛的组织中表达量较高.同时构建了DDB2基因RNA干扰(RNA interference)载体,并利用根瘤农杆菌介导的番茄转化技术获得转基因植株.     

新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现花叶、畸形以及坏死症状的加工番茄病株上获得黄瓜花叶病毒分离物，用1对CMV CP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了776bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体PUCm-T中转化大肠杆菌DHSa。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的776bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，重组克隆含1个开放阅读框架（ORF），长度为657nt，编码218个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的核苷酸同源性高达91．0％-98．9％．而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在76．4％-78．2％，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的氨基酸同源性高达94．2％-98．6％；而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在79．9％～83．5％．CMV亚组Ⅰ的株系较CMV亚组Ⅱ株系同源关系更密切，所以CMV新疆分离物应该归属于CMV亚组Ⅰ。     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸。其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS 具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

新疆天山北部地区加工番茄上ToMV和CMV的动态分析

为研究加工番茄上ToMV和CMV消长动态,采用RT-PCR方法对新疆天山北部6个地区采集的加工番茄样品进行了分子检测。结果表明:不同地区的138份加工番茄样品中,石河子、奎屯、乌苏的样品在存在CMV和ToMV,并以CMV为主,ToMV次之;从石河子蔬菜研究所,按不同品种不同时间采集的加工番茄660份样品中,CMV的检出率为21.5%,ToMV的检出率为12.1%,2种病毒的复合检出率为8.9%,病毒的检出率明显低于往年;CMV和ToMV分别在6月25和7月11日左右开始发生,CMV比ToMV早发生10-15 d。2种病毒的发生高峰期都在8月中下旬,复合侵染发病期在7月下旬;品种间2种病毒的消长动态没有明显的差异。     

吐鲁番温室番茄病株及传毒烟粉虱的双生病毒检测与鉴定

为了明确吐鲁番地区温室番茄黄化曲叶病的病毒种类及传毒烟粉虱的生物型及携带病毒的情况,本研究利用番茄黄化曲叶病毒的特异引物通过PCR检测和DNA测序,对温室采集的43个番茄病株进行了病毒种类的分子鉴定;利用烟粉虱特异引物和番茄黄化曲叶病毒特异性引物通过PCR检测和DNA测序,对鄯善县温室采集的180头烟粉虱进行了生物型鉴定和带毒检测,并构建了双重PCR检测方法。结果显示:吐鲁番市和鄯善县温室发生的番茄黄化曲叶病的病毒种类为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),病株带毒率为39.5%。鄯善县温室发生的烟粉虱主要为Q型烟粉虱,带毒率为67.8%,是主要的传毒介体。本研究建立的双重PCR检测技术,能快速有效地确定Q型烟粉虱的生物型和携带TYLCV的情况。     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。