福建省松树线虫的研究Ⅱ.松干伞真滑刃线虫的种类续述

本文为福建省松树线虫调查的第二部分,报道3种伞真滑刃线虫,即瑞氏伞真滑刃线虫Bursaphelenchus rainulfi Braasch,2002、泰国伞真滑刃线虫Bursaphelenchus thailandae Braasch,2002和伞真滑刃线虫未定种Bursaphe-lenchussp.瑞氏伞真滑刃线虫在形态描述上与原始文献相同,a值和b值与原始数据略有差别;泰国伞真滑刃线虫各项测量数据与原始文献均接近;伞真滑刃线虫未定种与小松伞真滑刃线虫(Bursaphelenchus.pinasteri)相似,但未定种热杀死后尾部弯成钩状,末端钝圆无尾尖突,口针基部有膨大,且a值和c值与小松伞真滑刃线虫有较大差别.     

松树体内寄生线虫种类及其致病性

松树是我国重要的造林先锋树种与景观绿化树种,然而,近年来在许多地方发现有不明原因、不同症状的枯萎松树,不同种类的寄生线虫在枯萎松树中被发现.笔者对松树体内的寄生线虫以及这些寄生线虫的致病性进行了综述.到目前为止,在我国松树上已经发现寄生线虫有11属42种以及11个未定种.除松材线虫外,一些线虫如拟松材线虫、Bursaphelenchus sexdentati等也能够引起某些松树的死亡.     

我国松树寄生线虫分类检索

到目前为止,在我国松树体内已经发现有寄生线虫46个已知种和一些未定种。分属于3目9科17属。其中,滑刃目(Aphelenchida)线虫数量最多,包括滑刃科（Aphelenchidae）滑刃线虫属(Aphelenchus)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus),外滑刃科(Ektaphelenchidae)外滑刃线虫属（Ektaphelenchoides）、外真滑刃线虫属(Ektaphelenchus)、隐滑刃线虫属（Crytaphelenchus）,长尾科(Seinuridae)长尾线虫属(Seinura)等,总共40个已知种。垫刃目(Tylenchida)包括粒科(Anguinidae)茎线虫属（Ditylenchus）,伪垫刃科(Nothotylenchidae)柱形垫刃线虫属（Cylindrotylenchus）,纽带科(Hoplolaimidae)拟盘旋线虫属(Pararotylenchus),环科(Criconematidae)小环线虫属（Criconemella）、鞘线虫属（Hemicycliophora）等,共6个已知种。矛线目（Dorylaimida）仅有1个未定种。根据不同目、科、属、种的线虫主要形态鉴定特征,编制了46种松树寄生线虫分类检索表,从而有利于人们方便地鉴定和区分松树寄生线虫.     

江苏省松树根际寄生线虫种类鉴定

从江苏省南京市江宁区、南京市紫金山、镇江市、淮安市、连云港市和扬州市等5个市6个地区采集80份马尾松(Pinus massoniana)、黑松(P.thunbergii)、湿地松(P.elliottii)和赤松(P.densiflora)的根和根际土壤样品,并分离鉴定其中的寄生线虫,初步分析结果如下:从采自南京紫金山上健康的马尾松根际中分离得到双宫螺旋线虫(Helicotylenchus dihystera)和松拟盘旋线虫(Paratylenchus pini);从南京江宁区衰弱马尾松根际中分离得到斯氏细小线虫(Gracilacus stei-neri)、尖头细小线虫(G.epacris)和斯特林细小线虫(G.straeleni),从健康马尾松根际中分离得到布科文针线虫(P.bukowinensis);从扬州市健康的马尾松根际中分离得到苹果矮化线虫(Ty-lenchorhynchus malinus);从镇江市健康黑松根际中分离得到微小针线虫(P.minutus)。其中,马尾松是苹果矮化线虫、布科文针线虫、斯特林细小线虫、尖头细小线虫和斯氏细小线虫的新寄主,黑松是微小针线虫的新寄主。同时,布科文针线虫、斯特林细小线虫、尖头细小线虫和斯氏细小线虫为江苏省的新纪录种。     

越南枯死松树症状特征和体内寄生线虫种类调查

为确定造成越南松林的枯死是否为松材线虫所为,对越南南部的林同省、中部的承天-顺化省、北部的广宁省的思茅松(Pinus kesiya Royle)、马尾松(P. massoniana Lamb.)和南亚松(P. merkusii jungh et de Vries)松树枯死现象及症状特点进行了调查,分别从52株枯死、濒死、健康松树木质部中抽取木质部样品,进行线虫分离,根据形态学特点确定这些松树体内寄生线虫的种类。调查发现松树在枯死过程中,树冠部分针叶失去光泽,逐渐褪绿变黄,进而褐红干枯,最后整个树冠变为褐色或红褐色,全株枯死,针叶下垂且当年不落; 随着病程的发展,松脂分泌逐渐减少,直至停止; 树干上有天牛产卵刻槽,死亡的松树上有天牛的羽化孔。在抽取的松树样品中分离鉴定到了泰国伞滑刃线虫(Bursaphelenchus thailandae)、悬臂伞滑刃线虫(B. gerberae)、中华伞滑刃线虫(B. sinensis)、树木伞滑刃线虫(B. silvestris)、托斯卡纳伞滑刃线虫(B. tusciae)、莱奴尔夫伞滑刃线虫(B. rainulfi)、云杉小蠹伞滑刃线虫(B. rufipennis)和伞滑刃属线虫未定种(B. sp.),调查中未发现重要检疫性病原松材线虫(B. xylophilus)。     

马尾松包装木的树皮象伞真滑刃线虫新记录

2002年从厦门口岸出口的71批货物木包装的83份样品中,多次检出多种伞真滑刃线虫(Bursaphelenchusspp.),有拟松材线虫(B.mucronatus)、奇异伞真滑刃线虫(B.aberrans),还从9份马尾松(Pinusmassoniana)木包装样品中检出另一种线虫,经形态学观察、测量,鉴定为树皮象伞真滑刃线虫(Bursaphelenchushylobianum(Korenchenko,1980)Hunt,1997).其特征是雄虫交合刺大而强壮,末端有帽状突起,髁突明显突起,靠腹面喙突钝圆,雌虫阴门处有小的阴门盖,尾部末端钝圆,明显向腹面弯曲.室内培养表明该线虫很容易在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)培养物上继代繁殖.该线虫为中国的新记录种,马尾松为该线虫的寄主新记录.     

福建省松树线虫的研究III.湿地松上长尾属线虫一新种

在福建省泉州市洛江区的湿地松(Pinus elliottii)上发现长尾属一新种,命名为福建长尾线虫(Seinura fujianensis n.sp.).福建长尾线虫与李氏长尾线虫(Seinura lii)最为相似,两者的主要区别是:前者雌虫热杀死后尾部微向腹面弯曲,后者弯曲明显;前者口针较短(雌虫分别为13～15 μm,16.3～20.1 μm,雄虫分别为12～15 μm,16.8～18.7 μm),口针基部微膨大,后者口针无口针基部球,亦不膨大;前者雄虫尾部较短(分别为26～36 μm,48～64 μm),c′值较小(分别为1.6～2.5,2.7～3.6).     

松树寄生线虫的收集与保存

枯死松树体内寄生线虫种类较多,笔者共收集了线虫资源212个株系.按线虫种类分,包括松材线虫171个株系,拟松材线虫22个株系、霍夫曼尼伞滑刃线虫5个株系、薄荷滑刃线虫1个株系、大核滑刃线虫8个株系、长尾属线虫3个株系以及外滑刃科线虫2个株系,松材线虫收集率为80.7%.按线虫来源分,包括中国线虫198个株系、日本线虫10个株系、美国线虫2个株系、加拿大和韩国线虫各1个株系,中国线虫收集率为93.4%.将212个线虫株系用灰葡萄孢菌培养保存,其中173个株系松材线虫、5个株系拟松材线虫及其他线虫5个株系还采用了DNA-20℃和-80℃保存.这是我国首次大规模保存松树线虫资源.     

云南西部地区松树根际捕食线虫真菌资源研究

植物寄生线虫造成的危害极大,开展捕食线虫真菌资源的研究是线虫生物防治的前提和基础.2006年至2007年间对云南西部云南松、华山松松树根际土中的捕食线虫真菌进行了调查,通过对分离到捕食线虫真菌土壤的地理位置、海拔的分析,结果表明:捕食线虫真菌在云南西部松树根际中广泛分布,从1000份样品中共分离、鉴定出捕食线虫真菌3个属(Arthrobotrys,Drechslerella,Dactylellina)21种和5个未产生捕食器的相关属Dactylella以及菌丝不分隔的捕食线虫真Stylopage属的1个种和Tridentaria属的1个种,其中2个为待定种.优势种为Arthrobotrys oligospora,Arthrobotrys musiformis,Arthrobotrys thaumasia,Dactylellina ellipsospora.在所分离到的捕食线虫真菌中,产生粘性菌网的菌种占优势.     

滑刃属线虫1个中国新记录种

2017年在安徽省黄山博村林场枯死的马尾松（Pinus massoniana）树体内分离得到一种不常见的线虫。经光学显微镜初步观察，该线虫在枯死松树内种群单一且数量较多。为研究其与松树枯萎的关系，从形态学和分子生物学特征对该线虫进行系统描述，确定该线虫的种属并对线虫数据库进行补充，以便于更好进行线虫的鉴定与分类，为松枯萎病的相关研究提供参考。     

松材线虫病死木中真菌和细菌的分离

从来自江苏省和浙江省几个疫区的松材线虫(PWN)病病死木的木质部中分离出111个真菌菌株，经鉴定种类为木霉(Trichoderma spp．)、轮枝霉(Verticillium spp．)、青霉(Penicillium spp．)、镰孢霉(Fusarium spp．)、曲霉(Aspergillus spp.)、毛壳菌(Chaetomium spp．)、茎点菌(Phoma spp．)、短梗单孢霉(Dicoccum sp．)、头孢霉(Cephalosporium sp．)、交链孢霉(Alternaria sp．)，这些真菌约占分离真菌总数的60％；在43％的未鉴定菌中，除3个菌株为有孢菌外，其余均是无孢菌。可以分离出真菌的病死木占56．42％，从病死木中可分离出细菌的比例达86％，可同时分离到真菌和细菌的比例为43．6％。     

松材线虫携带细菌的鉴定和毒性研究

从松材线虫病致死的松材木质部和松材线虫体表分离到3个出现频率较高的细菌菌株，菌株Nji、Njt和Njw。经鉴定3种细菌分别为荧光假单胞菌I型（Pseudomonas fluorescens biotype I)荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biotype Ⅱ）和泛菌属某种（Pantoea sp.)。用牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡培养细菌，培养液直接处理黑松愈伤组织，测定各细菌的产毒能力。与对照（空白培养液）相比，3种细菌的培养原液都可对黑松愈伤组织产生明显影响，其中菌株Nih和菌株Njt可以在2d内使愈伤组织明显变色，菌株Njw处理变色较慢。表明菌株Nij和Njt培养液内有大量致萎毒性物质存在。     

不同马尾松种源对松材线虫病的抗病性

在１９９５～１９９８年连续４ａ的人工接种试验中,从全国４０个马尾松种源中选出的广西２号、广西３号和广东５号３个抗松材线虫病种源的抗性稳定,无任何感病症状,其它种源均有不同程度的感病症状,抗病种源的抗性表现与下列因子有关：（１）３个抗病种源生长势均是较旺盛的;（２）抗病马尾松种源ＣＡＴ的活性强于敏感和轻感和轻感种源;（３）抗病种源广西２号的１０种游离氨基酸含量较其它感病和敏感种源的含量低;（４）抗病     

植物内生菌Bacillus spp.与松材线虫病的关系研究

松材线虫病是重要的森林病害,其致病机理还没有完全研究清楚.从马尾松健康树和松材线虫病树中分离到属于芽孢杆菌Bacillus spp.的植物内生菌,此菌及其代谢产物对断根松苗和离体松枝均有致病作用,且致病症状与松材线虫病类似,但对正常生长的松苗没有作用.这说明这种植物内生菌与松材线虫病有关,是一种弱致病菌.用1 mmol/L的苯甲酸溶液处理接种了松材线虫的松枝,松枝内的线虫照常增殖,但松材线虫病得到抑制.这说明植物内生菌是导致松材线虫病的内因,松材线虫是激发因子之一.     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

松材线虫体内细菌对宿主繁殖和致病力的影响

为探讨松材线虫体内细菌在松材线虫病中的作用,对无菌松材线虫、体内细菌处理的松材线虫和野生型松材线虫的繁殖量和致病力进行了测定。结果表明:在非寄生条件下,无菌松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖量显著高于携带细菌的松材线虫; 松材线虫体内寄生菌嗜麦芽窄食单孢菌NSPmBx03胞外代谢产物对松材线虫产卵量具有一定抑制作用。不同处理的松材线虫接种到3年生马尾松后,其繁殖量从高到低为野生型松材线虫>体内细菌处理的松材线虫>无菌松材线虫。对马尾松发病情况观察发现:接种野生型松材线虫的马尾松发病最早,病程最短; 次之为接种体内细菌处理的松材线虫; 最后是接种无菌松材线虫的处理。这表明嗜麦芽窄食单胞菌NSPmBx03对松材线虫在寄生和非寄生条件下繁殖的影响不同,对松材线虫致病力有一定增强作用。     

苦豆草生物碱对松材线虫的抑制作用

分别用槐果碱、苦参碱、槐胺碱、苦豆碱、野靛碱、N-甲基野靛碱、莱曼碱和总碱配制成生物碱浓度为1×10-4g/mL的PDA培养基,并在培养基上接种灰葡萄孢菌后再接种松材线虫,观察、记录松材线虫繁殖的情况。结果表明,苦豆碱、野靛碱和总碱对线虫的抑制繁殖作用都较强,其中,苦豆碱能完全抑制线虫的繁殖,且能引起线虫的死亡。对测定的生物碱的分子结构及对松材线虫的活性的分析进一步验证了关于双稠哌啶类生物碱对松材线虫的活性与其分子结构中的官能团对之间关系的假说。     

松幼苗和幼树离体枝对松材线虫侵染的反应

研究松树幼苗和幼树离体枝对松材线虫侵染的反应,表明组织褐变、失水萎蔫为病害外部症状表现标志;2月龄苗对线虫侵染的反应快速敏感,组织细胞褐变坏死反应明显。而茎已完全木质化的1 年生松幼苗和4~5年生幼树离体枝感染松材线虫后,外部症状表现为发病叶褪绿、变红褐色或褐色且萎蔫,症状首先出现在叶基部,很快向叶尖扩展,至整个针叶枯萎死亡。叶部症状的出现标志病害进入发展晚期,寄主已接近完全死亡,茎内失水和细胞褐变坏死已广泛发生。组织细胞褐变坏死反应则直接与线虫的迁移扩散、分布和数量有关。肉眼可见的皮层和髓的褐变通常发生在线虫出现之后,其褐变程度与线虫的数量呈正相关。