基于序列信息高度集成的长单链DNA自组装及制备

DNA折纸术(DNA origami)是DNA纳米自组装的一种主流方法,通常1条DNA主链在成百上千条合成的DNA短链辅助下,通过碱基互补配对原则折叠并锁定生成所设计的纳米结构.单链DNA折纸术(single-stranded DNA origami,ssDNA origami)是传统DNA折纸术的一种进化和衍生,它摒除了传统折纸术对众多短序列的需求,通过高度集成序列信息至1条长单链DNA中,实现了由1条DNA序列自组装成复杂可控的纳米结构.由于体系中不存在过量的短DNA链杂质,并且同样可以顺利移植成单链RNA折纸术,单链DNA折纸术较传统DNA折纸术可能具备更好的生物和材料应用前景.本文概括了长单链DNA自组装的研究进展,总结了几种常用的长单链DNA制备的方法,并展望了该技术的应用前景.     

退火时间对二维DNA晶体自组装的影响

DNA自组装的过程,不仅需要合适的缓冲液,还需要适当的退火时间.本文利用DNA自组装技术,以反向平行双交叉(double-crossover,DX)DNA分子瓦(DNAtile)作为建筑模块,带有互补黏性末端(sticky-ends)的分子瓦依据Watson-Crick碱基互补配对原则配对连接,成功制备出二维晶体结构.比较不同退火时间下形成的DNA分子瓦结构,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-denaturing PAGE)表征.结果表明,退火时间为2.5h时形成的分子瓦的结构较稳定.等量混合此条件下形成的不同分子瓦,分别从50,37和25℃退火至室温,利用原子力显微镜(AFM)对退火后的结构进行表征,结果表明,起始退火温度为37℃时得到的DNA二维晶体较平整.     

设计及自组装六边形网格状DNA二维阵列

根据Watson-Crick DNA碱基互补配对原则,设计了不同黏性末端DNA序列,以两种三点星状为模块(three-point-star motif),运用DNA自组装技术,成功制备了六边形网格状DNA二维阵列.研究不同单链DNA的摩尔比例对三点星状模块结构组装的影响,以及不同起始退火温度对二维阵列自组装的影响,用凝胶电泳及原子力显微镜(AFM)对结构进行了表征.结果表明,当构成三点星状模块的3条单链摩尔比例为1:3:3时得到的模块结构更稳定,从50℃开始退火时得到的二维阵列更完整.自组装得到的二维阵列厚度约2nm,六边形边长约20nm.本研究为进一步探究三点星模块组装二维阵列的机理提供了新的思路.     

纳米金颗粒在石英晶体微天平检测DNA中的表面修饰作用

采用石英晶体微天平(QCM)技术, 用不同粒径的纳米金颗粒来进行QCM的表面修饰, 提高对单链靶标DNA的检测灵敏度. 在相同的实验条件下, 通过研究5~60 nm范围内不同粒径纳米金颗粒对QCM表面的修饰作用发现: 金颗粒粒径的大小对DNA探针在石英晶体微天平表面的固定量和DNA的杂交率均有影响. 20 nm粒径的金颗粒对QCM表面修饰作用为最佳, 能最好地提高DNA检测灵敏度.     

三丙二酸富勒烯对DNA限制性内切酶和Taq DNA聚合酶活性的抑制作用

采用具有HindⅢ和EcoRⅠ单一酶切位点的pEGFP-N1超螺旋型质粒为底物, 检测三丙二酸富勒烯(trimalonic acid C₆₀, TMA C₆₀)对DNA限制性酶切反应的作用. 同时以该质粒为模板, 测定TMA C₆₀对Taq DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的影响. 酶切产物与PCR扩增产物均通过琼脂糖凝胶电泳来显示. 实验发现, 在质粒酶切体系或PCR体系中添加TMA C₆₀后, 酶切或扩增产物的生成量均显著减少. TMA C₆₀的作用存在浓度依赖性, 对HindⅢ, EcoRⅠ两种酶切反应和PCR的半抑制浓度IC₅₀值分别为16.3, 6.0, 6.0 μmol/L. 两种活性氧清除剂L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和叠氮化钠在浓度为2～10 mmol/L时, 不能拮抗TMA C₆₀对PCR和两种酶切反应的抑制作用. 但是, 在PCR体系中增加Taq DNA聚合酶能够拮抗TMA C₆₀的作用. 这些结果表明, TMA C₆₀能够抑制上述3种DNA代谢相关酶的活性, 其作用可能与活性氧无关.     

一种检测DNA单链断裂的新方法——缺口转译

在生物学研究中,经常需要检测DNA单链断裂。目前常用的方法有四种:碱性洗脱法、碱性梯度沉降法、羟基磷灰石色谱法和类核沉淀法。它们操作复杂,实验条件不易控制,而且定量分析困难。本文介绍一种检测DNA单链断裂的新方法——缺口转译。这是分子生物学研究中常用的标记方法,将此方法试用于研究抗癌药物10-羟基喜树碱对DNA单链断裂及其修复的影响,得到了有意义的结果。     

DNA变异结构的扫描隧道显微镜研究

脱氧核糖核酸(DNA)是生命活动的主要遗传物质,它在不同的环境下可以产生结构变化,如经加热处理等会使DNA的舣螺旋发生解旋等变化。 最近有人用扫描隧道显微镜(STM)在人气下直接观察了裸露的B,A,Z-DNA的双螺旋结构和单链DNA的结构,证明了STM是研究核酸结构的有力工具。但经过变性处理     

SAM自由基酶研究进展:新反应与新机制

S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)自由基酶是当今酶学领域的研究热点.该类酶通过结合的辅因子SAM和[4Fe-4S]簇催化生物体中一系列重要的自由基反应,自2001年被正式命名以来,成员不断壮大,目前已成为最大的酶家族之一.近年来, SAM自由基酶领域有大量新反应和新催化机制被报道.本文对近5年部分代表性成果进行酶催化机制的介绍,内容涉及核糖体肽翻译后修饰、核苷类化合物以及多种小分子生物合成.通过底物分类,让读者更容易理解SAM自由基酶催化反应的广泛性与多样性.同时对该领域新发现的新颖的有机金属催化自由基反应机制进行了介绍,并对SAM自由基酶领域的未来发展方向进行展望.     

基于分子瓦自组装的DNA纳米管的制备与表征

利用DNA分子自组装技术可以构建从一维到三维不同形状的纳米结构,并且这些结构在微纳米电子学、纳米生物学等众多领域有许多潜在的用途.本文利用DNA分子瓦(tile)自组装技术,采用双交叉(DX)DNA分子瓦成功组装了一维DNA纳米管结构,聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)、透射电子显微镜(TEM)、荧光显微镜和原子力显微镜(AFM)对制得的DNA纳米管结构进行了表征,结果表明,组装成功的DNA纳米管直径在7～20nm之间,长度最长可以达到50μm以上.为了结构更加稳定,对分子瓦中每条DNA单链的5′末端进行磷酸化处理,自组装完成后利用T4DNA连接酶连接磷酸化修饰的DNA纳米管的缺口.AFM结果显示,使用T4DNA连接酶处理后的DNA纳米管更能保持完好的管状结构,表明连接处理后的DNA纳米管更加坚固,促进了DNA纳米管应用于微纳米领域的研究.     

以β-环糊精作为模拟酶的动力学研究中催化加速程度的误差纠正

以β-环糊精(β-CD)作为模拟酶的动力学研究是当前模拟酶化学领域中的一个重要课题.据文[1]报道:β-CD 对于2-二茂铁基丙烯酸对硝基苯酚酯水解反应的催化加速程度k_c/k_(un)(k_c与k_(un)分别表示在相同pH 条件下β-CD 存在及不存在时水解反应的速率常数)高达360000,达到了典型的酶催化反应的数量级.这一结果引起了人们的重视并被广泛地引用.     

2’-O-甲基化修饰对Ribozyme活性的影响

锤头结构Ribozyme切割底物时的催化结构包括3个螺旋区和中间10核苷酸的单链区(编号为3～9,12～14,在我们过去文章中称3个双链区为茎区,现根据一些科学家的建议改称为螺旋区.我们原称的茎Ⅰ现称螺旋Ⅲ,原茎Ⅲ现称螺旋Ⅰ,原茎Ⅱ称螺旋Ⅱ).在我们实验室进行的机制研究表明3个螺旋区碱基配对的强弱以及螺旋的构象可影响反应的最适温度和切割效率.将螺旋Ⅰ和/或螺旋Ⅲ的RNA·RNA配对改为RNA·DNA(或DNA·DNA)配对既减弱了Ribozyme与底物的相互作用又改变了螺旋的构象,使反应的最适温度与切割效率都降低很多,有的甚至几乎看不到切割活性.将螺旋Ⅱ的RNA·RNA配对改为DNA·RNA配对只影响螺旋Ⅱ的构象而不影响Ribozyme与底物的相互作用,结果也使反应的最适温度和切割效率降低,但影响较小.为提高Ribozyme稳定性又不影响或少影响它的切割效率,我们研究了2’-O-甲基化对Ribozyme活性的影响.     

体外λ-DNA形成新结构的证据

1990年白春礼等人首次用扫描遂道显微镜(STM)直接观察到λ-DNA经热变性后在体外形成一种三链辫状结构。这一结果不同于目前提出的三螺旋模型,即第三条链缠绕于双链DNA的大沟之中。据文献报道,用同型嘌呤和同型嘧啶或以单链DNA和双链DNA反应所得到的三链物比双链DNA有较低的熔解温度(T_m),在解旋过程中280nm光吸收值明显提高,对DNaseI酶不敏感等特征。三链辫状DNA的某些物化性质可能不同于     

天然产物中β-位甲基化氨基酸单元的生物合成研究进展

相对于组成蛋白质大分子的20种标准氨基酸,更多的非标准氨基酸(将近500种)被引入天然产物的生物合成中,后者对于天然产物发挥独特的生物学功能具有至关重要的作用.β-位甲基化氨基酸作为一类非标准氨基酸,在一些活性天然产物的生物合成中及初级代谢中也有很多报道.它们的生物合成主要通过3种方式:(1)谷氨酸变位酶催化;(2)甲基转移酶和氨基转移酶联合催化;(3)S-腺苷甲硫氨酸自由基酶催化.本文综述了近年来文献中报道的天然产物中β-位甲基氨基酸单元的生物合成方式,通过代谢工程、合成生物学及酶工程的手段,将有助于提高含有该单元的活性天然产物的产量,同时有助于创造更多含有该单元的非天然-天然产物.     

以~(32)P后标记技术研究人血组分在DNA-致癌剂加合物AF-dG形成中的作用

DNA加合物的形成,即致癌剂对DNA分子的共价修饰是致癌的初始作用.绝大多数致癌剂必须先在生物体内酶系催化下形成亲电子的代谢物,然后与靶细胞DNA亲核部位共价结合。报道据,肝脏和一些肝外组织的细胞色素P-450及其他氧化酶系参与基因毒性化合物的生物活化.血液各组分有各种氧化酶活力,人血细胞在外源致癌剂生物活化的作用,     

质粒pUC18 DNA的超凝集结构

1966年Vinograd论述了双链DNA有四种不同的拓扑结构形式:超螺旋DNA(Ⅰ型)、松弛型DNA(Ⅱ型)、线型DNA(Ⅲ型)以及碱变的超螺旋DNA(Ⅳ型)。后来,一组瑞士科学家证实了由互补单链环形DNA在体外退火形成的Ⅴ型DNA。1990年,黄熙泰等人发现从Ⅱ型DNA拓扑异构酶缺陷的大肠杆菌SD 108株细胞制备的质粒pBR 322 DNA样品含有一种区别于已知五种结构类型的DNA成分。由于它的高密度和高淌度,这种成分被称为超凝集型DNA(Super condensed DNA)。     

光驱动F0F1-ATP合酶复合物顺时针旋转的观察

将含有10个组氨酸的嗜热菌F1β亚基通过杂交引入光合细菌载色体(Chromatophores)复合物的F0F1-ATP合酶中. 对该杂交复合物的生化性质研究表明, 其具有较好的质子转运能力, 杂交的FoF1-ATP合酶能够有效地催化载色体的光合磷酸化, 其F1β亚基的10个组氨酸可与Maleimido-C3-NTA连接后再与FITC标记的肌动蛋白微丝连接. 光照后在荧光显微镜下观察到, 与该杂交复合物β亚基连接的荧光微丝顺时针方向旋转, 即质子动力势(pmf)引起的FoF1-ATP合酶F1β亚基(或α3β3六聚体)上荧光微丝的顺时针方向旋转. 初步建立了F0F1-ATP合酶在pmf推动下F1β亚基(或α3β3六聚体)旋转的研究体系.     

HMG蛋白质(1+2)的功能研究

HMG蛋白质是一类酸溶性的非组蛋白质,虽然这类蛋白质在染色质内的含量非常丰富,但有关它们的生物学功能目前依然不清楚.本文对HMG蛋白质(1+2)与β-CAT质粒DNA相互作用的模式进行了初步分析.实验结果表明这类蛋白质能促使β-CAT质粒DNA解螺旋,此外,在质粒DNA的局域部位,还能观察到DNA环结构的形成.     

DNA纳米技术在凝血酶适配体分子设计中的应用进展

DNA纳米技术是纳米生物技术的一个重要研究领域,近年来发展迅猛.通过合理的设计,利用DNA或其他核酸的分子性质构建出可操控的新型纳米尺度的结构或机器,在生物医学应用领域中有广泛应用.本文介绍了利用DNA纳米技术对凝血酶适配体结构合理设计的相关进展.     

以溴化乙锭为荧光探针研究二氯二茂钛与DNA作用方式

自1979年K(?)pf等发现二氯二茂钛(Cp_2TiCl_2,TDC)的抗癌活性以来,金属茂类配合物抗癌作用的研究成为继顺铂之后该领域中最为活跃的前沿课题之一,TDC具有抗癌谱广、药效高、毒性远低于顺铂的突出优点,已于1992年在德国进入临床研究.生物学实验表明,DNA是TDC在细胞内的主要靶分子,但TDC与DNA的作用方式仍是未知的.McLaughlin等的研究表明,TDC可与DNA作用形成Cp_2Ti-DNA及CpTi-DNA复合物,文献[4,5]通过研究TDC与单核苷酸及DNA的作用,提出了TDC与DNA发生不可逆共价结合的作用模式.本文以荧光探针技术研究了TDC与DNA的结合方式及其对DNA二级结构的影响.     

大熊猫高度重复序列DNA的分子克隆

有关中国特有的濒危物种大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是属于熊科(Ursidae)、浣熊科(Procyonidae)或大熊猫科(Ailuropodidae)的分类争论已延续了120年之久。近年来,根据单链DNA杂交、同工酶遗传距离、免疫距离、染色体G带及蛋白双向电泳等方法分析的结果,建议将大熊猫归类为熊科动物大熊猫亚科。这些研究均依据“分子钟”假说。 在真核生物基因组高度重复序列DNA,尤其在限制性卫星DNA的研究中,已查明某些卫星DNA与生物进化有关,某些卫星DNA表现出某种属(Genus)专一性,而某些卫