Armillariella tabescens发酵生产菌丝体复合多糖的条件

试验研究了5 L发酵罐上液体深层培养假密环菌,生产菌丝体复合多糖的发酵条件,同时比较用酵母泥作培养基和用马铃薯作培养基发酵过程中假密环菌的生长情况、产多糖量和菌丝体生长形态.结果表明:接种量为5%,温度(26.0±0.5)℃,pH为6.00±0.2,溶氧保持在20%以上;从培养开始到收罐的0~85 h,搅拌速度从80 r/m in到160 r/m in分阶段递增;补料分批发酵,上罐培养3~4 d为最适发酵条件.使用马铃薯复合培养基发酵的发酵液中菌密度最高可达11.541 g(干质量).L-1,而使用酵母泥复合培养基菌密度最高达9.657 g(干质量).L-1,前者比后者高出19.51%.而酵母泥培养基的多糖质量浓度则最高达1.27 g.L-1,比马铃薯培养基高出22.83%.且平均培养时间比马铃薯培养基缩短12 h.     

新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶RuAra1的表达与鉴定

随着能源问题的日益突出,半纤维素资源的利用逐渐受到人们的重视.α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Larabinofuranosidase,EC 3.2.1.55)属于半纤维素酶系,能水解以α-1,3、α-1,2或α-1,5键连在木聚糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚阿拉伯糖侧支.本实验室将克隆得到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因RuAral在大肠杆菌中重组表达,得到的重组阿拉伯呋喃糖苷酶RuAral能够水解4-硝基酚-α-L-阿拉伯糖苷(4-Nitrophenyl-α-Larabinofuranoside,pNPA)、4-硝基酚-β-D-吡喃木糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,pNPX)以及从小麦阿拉伯木聚糖中水解释放阿拉伯单糖.以pNPX为底物时,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃.RuAral与瘤胃真菌(Neocallimastix patriciarum)内切木聚糖酶XynCIDBFV、瘤胃细菌木糖苷酶RuXynl的组合使用可以实现对小麦阿拉伯木聚糖的协同降解,且降解效率优于德国AB酶制剂公司的商品酶ROHALASE WP.     

人spindlin 1基因全长cDNA的克隆与定位

利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236～949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核.     

玉米PDE191基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

为研究玉米白化相关基因PDE191序列信息和基因功能,以玉米叶片总RNA逆转录后的c DNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出玉米PDE191基因全长c DNA。DNA测序及生物信息学分析表明,玉米PDE191基因c DNA全长1229 bp,编码333个氨基酸的蛋白质,亚细胞定位于线粒体和叶绿体。软件预测PDE191蛋白分子量为37.79 k D,理论等电点为9.12,该蛋白二级结构主要构成元件为?螺旋和无规则卷曲,包含7个MTERF结构域。三级结构预测显示该蛋白为球状结构,预测结果与二级结构预测的结果相符。对该蛋白进行多重序列比对和聚类分析显示,PDE191属于植物MTERF家族,在不同植物中存在其同源蛋白质,其中与拟南芥PDE191氨基酸序列的相似性高达99%。本研究为进一步研究玉米PDE191基因的功能奠定了基础。     

玉米PDE191基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

为研究玉米白化相关基因PDE191序列信息和基因功能,以玉米叶片总RNA逆转录后的c DNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出玉米PDE191基因全长c DNA。DNA测序及生物信息学分析表明,玉米PDE191基因c DNA全长1229 bp,编码333个氨基酸的蛋白质,亚细胞定位于线粒体和叶绿体。软件预测PDE191蛋白分子量为37.79 k D,理论等电点为9.12,该蛋白二级结构主要构成元件为?螺旋和无规则卷曲,包含7个MTERF结构域。三级结构预测显示该蛋白为球状结构,预测结果与二级结构预测的结果相符。对该蛋白进行多重序列比对和聚类分析显示,PDE191属于植物MTERF家族,在不同植物中存在其同源蛋白质,其中与拟南芥PDE191氨基酸序列的相似性高达99%。本研究为进一步研究玉米PDE191基因的功能奠定了基础。     

大黄鱼免疫球蛋白M重链基因全长cDNA序列的克隆与表达

从本实验室自建的大黄鱼表达标签数据库中获取了大黄鱼免疫球蛋白M重链(LcIgMH)基因片段,并以此设计SMART-RACE引物,最终得到1917 bp的全长c DNA序列。经分析发现其含6 bp的5'非编码区(5'UTR)、176 bp的3'UTR以及1738 bp的开放阅读框(ORF);预测的ORF共编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65. 2 ku,等电点为5. 84;利用Singal P 4. 1 Server发现其5'端含有信号肽(1-19 aa);Blast P Server的结果显示,其与红笛鲷的IgMH序列一致性最高,达到64%;利用IMGT/Domain Gap Align进行重链可变区与恒定区预测,发现含有1个重链可变区与4个重链恒定区,同时,预测还发现可变区含有典型的3个高变区与4个骨架区结构。实时荧光定量PCR结果显示该基因在头肾与脾脏中大量表达,并显著高于其他各组织,同时雌雄鱼LcIgMH在各组织中表达量均无显著性差异,表明LcIgMH表达与性别无关。注射副溶血弧菌进行感染4 d后,脾脏内LcIgMH表达量最高,并且与对照组之间存在显著性差异(P 0. 05),但感染后第8天的表达水平已与对照组无显著性差异(P 0. 05),显示LcIgMH与大黄鱼的免疫应答反应相关。     

人新的PLP基因全长cDNA的克隆与分析

在批量分离与脑发育相关的基因克隆时,从人3个月胎脑cDNA文库中得到一全长2261bp的cDNA克隆.其开放性阅读框架编码一个含有551个氨基酸残基的蛋白质,此蛋白与一种推测的细胞结构调节蛋白parelemmin同源,故命名为PLP(paralemmin-like protein).GenBank接受号为AF132731.Northern杂交显示该基因只有一个转录本,大小与获得的该克隆吻合.组织表达谱分析发现该基因在成人心脏、骨骼肌中的表达量高于其他组织.     

皱纹盘鲍Hdh-MMP-1基因cDNA的克隆及原核表达

利用同源克隆方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉组织中克隆得到基质金属蛋白酶-1基因(Hdh-MMP-1)cDNA全长序列(GenBank登录号:KR537291)。结果表明,Hdh-MMP-1 cDNA全长2136 bp,其中ORF长度为1551 bp,编码区含有516个氨基酸残基,预测其分子质量为58.94 ku,理论等电点为5.99。Hdh-MMP-1具有MMPs家族典型的N-端前肽区、催化区、铰链区和C-端类血红素结合区。利用SOPMA和SWISS-MODEL软件对该基因编码蛋白质高级结构进行了预测分析。氨基酸序列相似性结果显示,Hdh-MMP-1不仅与多种生物MMP-1基因具有序列相似性,且与某些软体动物和虫类的MMP-14及MMP-19也具有序列相似性。多序列比对结果显示,Hdh-MMP-1与红螺鲍、杂色鲍、美洲牡蛎的MMP-1相似性分别为95.29%、82.35%、38.85%。随后,构建了表达载体pET28a-catMMP-1,利用大肠杆菌原核表达系统,在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功对该蛋白质催化区进行异源表达。     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO6的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螫蟹卵巢获得了新基因EJO6(Eriocheir japonica ovary gene 6,EJO6)的全长cDNA序列(GenBarnk 检索号：AYl85922)。该cDNA序列长度为1250bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸。根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为24270和11．9。同时用生物信息学的方法对该基因的结构和功能进行了初步分析。     

黄颡鱼Scp3基因全长cDNA的克隆和表达模式研究

本研究采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长江流域重要的经济鱼类黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)中克隆了与减数分裂密切相关基因Scp3的全长cDNA,并对它的序列、系统进化、组织和细胞表达模式进行了研究。克隆得到的Scp3cDNA全长为1 143bp,编码240个氨基酸;系统进化分析表明黄颡鱼Scp3蛋白与同为鲇形目(Siluriformes)的斑点叉尾鮰(Ietalurus punetatus)Scp3蛋白同源性最高;序列分析结果表明,黄颡鱼Scp3蛋白含有脊椎动物Scp3蛋白保守的卷曲螺旋结构域(Coiled coil domain)和2个保守基序(CM1和CM2);组织和细胞表达模式的研究显示Scp3基因仅表达于黄颡鱼雌雄性腺:1)在精巢中仅表达于初级精母细胞和次级精母细胞;2)在卵巢中仅在初级生长期和卵黄发生前期表达。本文首次从黄颡鱼中克隆得到Scp3全长cDNA并对其进行组织和细胞表达模式的研究,为后续研究脊椎动物生殖细胞的分化及其相互作用奠定了基础。     

亮菌研究的现状与展望

亮菌属小蜜环菌属,是一种药食兼用的名贵真菌.从亮菌名称的由来及分类、亮菌的生物学特性、亮菌中所含的亮菌甲素和亮菌多糖等化学物质、亮菌的固态和液体发酵培养、亮菌的抗炎、防辐射、升白、抗肿瘤、增强免疫力等生物学功能5个方面对亮菌的研究现状进行了详细的综述,并对亮菌的研究前景进行了展望,为亮菌的进一步开发及研究提供参考.     

假蜜环菌产胞外多糖发酵的初步研究

在摇瓶和２１发酵罐水平上，研究了假蜜环菌产胞外多糖的发酵情况，并建立了一套方便可靠的检测方法。在摇瓶发酵中，探讨了培养基初始ｐＨ、初始糖浓度、装液量及钙离子等因素对假蜜环菌产生胞外多糖的影响，得出的优选条件为初始ｐＨ５．０，初糖浓度５％，每个５００ｍｌ瓶装液１００ｍｌ及添加１％碳酸钙。优选条件下在２１发酵罐中经７ｄ发酵后，胞外多糖产量可高达３．９９ｍｇ／ｍｌ。有关假蜜环菌胞外多糖的发酵研究，尚未见有报道。     

亮菌粗多糖对小鼠免疫功能的影响

通过对血清溶血素值、RES吞噬功能、IL-2的检测、NK细胞活性检测，研究亮菌多糖对小鼠免疫功能的影响．结果表明：亮菌多糖体内给药能激活小鼠网状内皮系统，增强其吞噬功能；能明显拮抗环磷酰胺所致的小鼠溶血素抗体的降低；能提高Con A诱导小鼠体内淋巴细胞产生白介素．2的能力；可以增强小鼠脾脏NK细胞的活性．说明亮菌多糖能使小鼠机体免疫力增强．     

蜜环菌液体发酵条件研究及其饮料开发

考察了各种发酵条件对蜜环菌液体发酵中菌丝生长的影响，确定了蜜环菌最适摇瓶培养条件，同时对乙醇的增菌进行了初步研究，实验表明1．0％～1．2％的乙醇溶液对蜜环菌的生长有较明显的增菌作用，利用蜜环菌发酵液加工出了保健饮料。     

中华鳖dct基因克隆及表达分析

为了阐明中华鳖酪氨酸酶家族成员dct基因的结构与表达特征,根据Ensembl数据库的中华鳖dct基因序列设计引物,运用RT-PCR技术进行开放阅读框(opening reading frame,ORF)克隆,并进行生物信息学分析,进而采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-PCR)技术检测正常体色和黄色中华鳖肺、肾脏、裙边和肌肉组织的mRNA表达水平.结果显示中华鳖dct基因ORF区全长1 578 bp,编码525个氨基酸,2种体色鳖dct基因序列完全一致;氨基酸序列分析得C末端无L-亮氨酸基序;N末端含有1个信号肽结构域;预测蛋白(成熟肽)分子质量为56.449 ku,理论等电点为6.67,不稳定指数为38.71,表明DCT蛋白是酸性稳定蛋白;预测DCT蛋白为亲水性蛋白;含有跨膜结构域、类表皮生长因子结构域、层粘连蛋白型类表皮生长因子结构域和2个铜离子结合结构域.系统发育树分析显示,在dct基因进化过程中,中华鳖与绿海龟和锦龟的亲缘关系较近.q-PCR结果表明:dct基因在同一个体各组织中均有表达,肺组织中相对表达量最高,且极显著高于其他3种组织;黄色中华鳖肺、肾脏和裙边组织dct 表达水平与正常体色鳖的相应组织均存在显著性差异.结果表明,中华鳖体色变异与dct基因突变无关,但dct基因表达改变可能对体色变异起了一定的作用.     

柽柳 GF14基因的克隆与表达分析

生物体中普遍存在的14-3-3蛋白(也称GF14蛋白)能够参与植物的一系列应激响应过程。笔者以柽柳(Tamarix hispida)为材料,从6个柽柳cDNA文库中分离出5条GF14 基因,依次命名为ThGF14a—ThGF14e。对5条GF14 基因进行生物信息学研究,并利用qRT-PCR技术对胁迫处理后的基因表达模式进行分析。结果显示:ThGF14 蛋白除了N和C末端的氨基酸外均含有一个高度保守的14-3-3 结构域,这些ThGF14蛋白分属于ε-like 和 non-ε 两种类型; 大多数 ThGF14基因在NaCl、PEG、4 ℃、CdCl₂处理不同时间(6,24,48 和 72 h)的叶和根中能够被诱导表达(表达量>2倍),且不同基因间对非生物胁迫应答表现出差异,其中ThGF14c 基因在叶和根中不同胁迫条件下的表达水平均最高。研究表明,柽柳 ThGF14 基因能够参与植物的非生物胁迫应答响应过程。     

角毛壳菌丝切蛋白基因的克隆和特性分析

在构建的角毛壳菌(Chaetomium cupreum)菌丝体cDNA文库中获得丝切蛋白(Cofilin)的ESTs序列片段,为研究角毛壳菌的生物特性,提高其生物防治效果,以角毛壳菌总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,成功获得了Cofilin基因cDNA序列.生物信息学分析结果表明,该基因全长468bp,编码155个氨基酸,编码蛋白理论分子量17kD,等电点是4.99,α-螺旋和无规则卷曲是其主要的二级结构,为亲水性蛋白质.该蛋白有6个位点发生Ser磷酸化,4个位点发生Tyr磷酸化,有4个保守区,ClustalX分析说明该蛋白与柄孢霉(Podospora anserina)和球毛壳菌(C.g lobosum)亲缘关系较近.     

旱麦草LEA3基因的克隆与序列分析

为了克隆旱麦草LEA3基因,根据小麦的LEA3基因(GenBank登录号为AY148492)cDNA序列设计引物,以干旱胁迫处理的旱麦草幼苗的cDNA为模板,采用RT-PCR克隆了旱麦草LEA3基因,命名为EtLEA3(GenBank登录号为KJ123698),并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:EtLEA3基因的ORF全长为600 bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白相对分子量为20.38 ku,理论等电点为9.08。其氨基酸序列与小麦、大麦和山羊草LEA3蛋白的相似性分别为83%、82%和81%。信息学分析表明EtLEA3蛋白具有较高的亲水性,没有跨膜结构。蛋白质二级结构和三级结构预测表明α-螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。该蛋白含有5个完整的11个氨基酸组成的串联重复单元。这些特征均与第3组LEA蛋白的特征相符合。该研究结果为深入了解该基因的功能和旱麦草抗旱的分子机理提供了基础数据。     

产微球茎菌琼胶酶基因的克隆及生物信息学分析

以琼脂为唯一碳源的培养基分离出一株产琼胶酶的海洋菌株AG1,16S rRNA基因序列分析显示,该菌株为产微球茎菌（Microbulbifer sp.）。以菌株AG1的基因组为模板,使用琼胶酶特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体后进行测序。结果显示,克隆基因的大小为1302 bp,预测编码含有433个氨基酸残基的蛋白质。对该蛋白质进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与来自耐热微泡菌（Microbulbifer thermotolerans）的琼胶酶氨基酸序列相似性为100%,预测本研究克隆的基因编码琼胶酶。该琼胶酶的理论分子质量大小为48.2 ku,理论等电点为5.42。采用同源建模法建立Microbulbifer sp.AG1琼胶酶的三维结构,富含β-折叠。