水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

过量表达OsDTH11基因对水稻穗发育和花粉育性的影响

为了探究水稻成花转变基因家族成员OsDTH11的功能,采用反向遗传学方法,构建OsDTH11的过表达载体并通过农杆菌介导转化水稻,获得了水稻OsDTH11过量表达转基因植株.分子检测结果表明:OsDTH11在转基因植株中的表达明显上升,说明过量表达载体正常工作,起到了过量表达作用.表型分析发现,过量表达OsDTH11不影响水稻成花转变的时间,但转基因植株表现出穗发育不良、结实率降低(只有野生型的46%).通过碘染法进行花粉育性鉴定,与对照植株相比,过量表达OsDTH11的转基因植株花粉育性明显降低,从而降低了水稻结实率,表明OsDTH11可能在水稻穗及花的发育方面发挥作用.组织特异性表达分析结果表明:OsDTH11在水稻各个组织中均有表达,在穗中表达量很高,在分生组织、叶片和根中表达较弱.这一结果也说明OsDTH11有可能在水稻穗的生长发育过程中发挥重要作用.     

bar基因表达框和完整质粒转化对水稻农艺性状的变异效应比较

通过分析转基因植株的株高、分蘖数、结实率、千粒重四个主要农艺性状的变异,比较基因枪法转化的基因表达框(仅含启动子、基因开放阅读框和终止子序列)和完整质粒两种基因载体形式对水稻农艺性状的变异效应.结果表明,与非转基因亲本相比,转基因植株的千粒重和分蘖数与对照无显著差异;株高变异也不大,17个转基因株系中,仅基因表达框转化的2个株系XFb-36和XFb-63株高变矮;而结实率变异最大,有9个转基因株系结实率显著降低,变异率达50%以上.总体上看,基因表达框和完整质粒两种基因载体形式对水稻农艺性状的变异效应差异不明显,基因枪转化对水稻农艺性状的变异效应主要表现为降低植株的育性,转基因水稻植株的农艺性状变异主要来源于转基因过程中组织培养引起的无性系变异.     

利用CRISPR /Cas9技术快速创制香型“秀水134”水稻

以目前上海市主栽的高产常规水稻"秀水134"为材料,利用CRISPR/Cas9技术成功敲除甜菜碱醛脱氢酶2基因,获得了两种类型纯合突变体植株.采用表达载体特异性结合的引物检测T_1代转基因植株,成功获得6株不携带载体骨架的转基因植株.定量PCR分析显示,突变体植株甜菜碱醛脱氢酶2基因表达量极显著低于野生型对照(p0.01),但突变体植株成熟种子香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)含量极显著高于野生型对照(p0.01).比较野生型对照与突变体植株的主要农艺性状和产量性状,两者间都没有显著差异(p0.05).本研究可为加快高产香型水稻在上海及周边地区的推广应用,以及为今后利用CRISPR/Cas9技术快速培育其他高产香型水稻新品种研究奠定基础.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体pFGC5941-BnBRI1和RNA干扰载体pFGC5941-BnBRI1-Ri,以根癌农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜"W679"下胚轴外植体,经PCR鉴定,获得18株转基因阳性植株,其中1株为BnBRI1基因过量表达转基因植株,17株为BnBRI1基因RNA干扰转基因植株.经RT-PCR鉴定显示,在过表达转基因植株中BnBRI1基因表达量比野生型甘蓝型油菜高,而在RNA干扰转基因植株中表达量比野生型低,RNA干扰BnBRI1基因的表达导致了植株的矮化,矮化植株将可用于油菜株型的遗传改良,以培育适于机械化生产的中矮秆油菜新品种.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

GmGASA6基因CRISPR-Cas9载体构建及大豆的遗传转化

通过对大豆GmGASA6基因的结构分析,选择了两个靶位点构建了GmGASA6 CRISPR-Cas9的基因编辑载体.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法进行了遗传转化,共转化外植体800个,获得了转基因阳性苗15株.通过测序证实部分T1代植株GmGASA6基因的靶位点发生了基因编辑.与野生型相比,种子萌发实验发现突变体的胚...     

利用CRISPR/Cas9技术构建GLUT4基因敲减的A549细胞系

目的:为探究GLUT4基因在肺癌细胞中的功能及影响.方法:在GLUT4外显子上设计了4个sgRNAs(S1、S2、S3、S4),分别与PX458载体连接形成重组表达载体后,借助转染试剂lipo3000将表达载体转入生长态势良好的A549细胞中,再利用流式细胞仪分选技术对转入重组载体发出绿色荧光的细胞进行单细胞分选.利用基因组测序筛选突变株,提取突变株的RNA和蛋白,进行Real-time PCR及Western Blot检测敲减效率,并利用激光共聚焦显微术检测突变株葡萄糖摄取量的变化.结果:突变株细胞在mRNA及蛋白水平均表现出GLUT4基因敲减效果,并在葡萄糖摄取上表现出明显的降低趋势.结论:利用CRISPR/Cas9系统成功建立了GLUT4基因敲减A549细胞系.     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

利用CRISPR-Cas9系统高效创制水稻品系“17318”的 OsGW2、OsGN1a基因定向突变体

CRISPR-Cas9系统在水稻功能基因的功能研究、性状改良与分子设计育种中起着重要的作用。本研究成功构建了水稻高效定向敲除OsGW2和OsGN1a的CRISPR/Cas9载体pZJP049。并将该载体通过农杆菌介导转化水稻"17318"愈伤,获得水稻再生苗。PCR扩增的方法进行转基因植株阳性检测,结果显示阳性率为100%。PCR-RFLP结果表明OsGN1a基因位点的突变效率为77.7%。PCR-SSCP检测结果显示OsGW2基因位点突变率为100%。双基因聚合突变体(gw2gw2gn1agn1a)的种子在长度和宽度均有明显增加,与预期一致。本研究通过CRISPR-Cas9系统快速聚合Gn1a, GW2基因,实现了目标性状的精确改良。     

水稻染色质重塑因子OsSWIB1的表达分析及其突变体的创建

SWI/SNF家族是ATP依赖的染色质重塑复合物，对基因的表达调控具有重要作用.为了探究水稻中染色质重塑因子OsSWIB1的功能，对OsSWIB1基因表达模式进行分析.结果表明：OsSWIB1在水稻的叶、叶鞘及穗中表达量较高，而在茎、茎顶端分生组织及根中表达量较低；在水稻不同的生长发育时期，除在苗期表达量较低外，OsSWIB1在分蘖期、孕穗期、抽穗期及灌浆期均有较高表达.此外，OsSWIB1在短日照条件下的表达明显高于在长日照条件下的表达.利用CRISPR-Cas9技术对OsSWIB1基因进行靶向编辑，共获得20株T₀代转基因植株，通过测序分析，鉴定出3个纯合编辑的突变体.对1个杂合编辑突变体的后代进行分离，获得了1个缺失200 bp的纯合突变体.     

水稻OsDDB2基因过量表达载体的构建及其转化

利用农杆菌介导法将构建好的水稻OsDDB2过表达载体导入水稻,共获得植株4株,经PCR检测确定4株皆为转基因植株.田间性状分析发现转基因植株的结实率(平均6.05%)远远低于野生型植株的结实率(平均87.4%).相应地,花粉粒I_2-KI染色结果显示转基因植株的花粉数远少于野生型植株的花粉数.这些初步实验结果为进一步研究水稻DDB2基因的功能奠定了基础.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因

低植酸是作物育种目标之一,然而植酸对植物自身的影响至今未有科学评估.为此,在建立粳型常规水稻"金粳818"再生体系基础上,利用农杆菌介导的遗传转化方法将针对植酸合成最后一步磷酸化反应的1, 3,4, 5, 6-五磷酸肌醇2-激酶基因IPK1构建的3个CRISPR/Cas9载体分别转入"金粳818".分子检测发现,再生的42株植株中,40株为转化株,显示转化率高达95%.靶点序列分析发现,26株绿色转化株中,1株基因组发生了编辑.编辑株靶点测序发现,除碱基缺失外,附近序列错配达30%.这些结果为水稻低植酸种质的创制及植酸的功能分析奠定了技术基础.同时,本文对水稻再生株的白化现象进行了探讨.     

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

一个NBS-LRR蛋白质基因转化水稻及其超量表达

水稻Osxoc1334是一个编码NBS-LRR类蛋白质的基因,通过构建该基因的超量表达载体,并在农杆菌EHA105介导下转化中花11号水稻,最终获得6株再生水稻植株.对抗性愈伤组织和再生植株用GUS组织化学染色检测,结果抗性愈伤组织和6株再生水稻植株均可染上蓝色,而野生型植株不变色,用潮霉素磷酸转移酶基因的特异引物进行PCR鉴定,再生植株均可扩增到目标条带而野生型植株则不能,表明Osxoc1334基因已随T-DNA整合到再生水稻植株基因组中.采用半定量和荧光定量PCR分析转基因水稻的Osxoc1334基因表达,结果其中3株转基因植株的Osxoc1334基因平均相对表达量明显增强,其中1株为野生型植株的23.5倍.这为进一步鉴定该基因功能奠定了基础.     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．