卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立

【目的】快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcus garvieae)4种主要的致病菌,为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。【方法】针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R,建立多重PCR反应体系,通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度,对反应体系进行优化及灵敏度测试。2014年6~8月,应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测,然后用通用引物扩增16SrRNA基因,经测序、比对检测体系的准确性。【结果】反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2μmol/L,0.08μmol/L,1.6μmol/L和0.4μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10~(-2) ng/μL;11份病原样品检测中,2份出现海豚链球菌的目的条带,4份出现无乳链球菌的目的条带,5份未见目的条带,和测序分析结果一致。【结论】多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌。     

SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果观察

观察SARS灭活疫苗对猴体的免疫原性及保护效果,为进一步的临床研究奠定基础.将BJ01株SARS病毒感染的Vero细胞的培养液过滤澄清,经β-丙内酯灭活和超滤浓缩,然后经凝胶过滤和离子交换层析获得纯化的SARS灭活疫苗.经HPLC分析其纯度为97.6%,在电子显微镜下可观察到SARS病毒样颗粒.蛋白质印迹(westernblotting)分析表明,纯化SARS灭活疫苗可与SARS患者恢复期血清起反应.纯化的SARS灭活疫苗符合有关的质量标准.用SARS灭活疫苗免疫猴体可产生高效价的中和抗体,可阻止SARS病毒在猴体内增殖,且对SARS病毒攻击具有保护作用.在低中和抗体情况下,用SARS病毒攻击免疫猴后没有出现感染增强现象.猴体免疫SARS灭活疫苗后,无论正常剂量还是大剂量疫苗免疫,均未发现局部和全身副反应,表明SARS灭活疫苗对猴体是安全的.     

尼罗罗非鱼精子发生的超微结构研究

对尼罗罗非鱼精子发生的超微结构进行描述.罗非鱼精子发生的类型属于A型,其发生顺序经历早期精细胞期;轴丝发生;细胞核凝缩和旋转;线粒体的迁移等过程.本文并讨论硬骨鱼类精巢结构和精子发生的有关问题.     

海豚的微笑与悲伤

去过海洋公园的同学,一定不会错过精彩的海豚表演。钻圈、顶球、飞跃,海豚矫健的身姿和俏皮的动作,给观众留下了难忘的记忆。     

鸭疫里默氏杆菌三价灭活疫苗的免疫保护期研究

选择免疫原性好的血清1,2,4型鸭疫里默氏杆菌（RA）分离株制备三价灭活油乳剂苗,疫苗抗原含量为5×109CFU/ml,分别用0.5,1.0和1.5ml/只剂量接种7日龄樱桃谷肉鸭以检验器其安全性;用0.25ml/只的剂量接种樱桃谷肉雏鸭,分别于免疫后第1、2、3,4、5和9周攻毒,以检验其免疫效果.安全性检验结果显示,肉雏鸭接种后未见局部和全身异常反应;攻毒保护试验结果显示,免疫后2～9周雏鸭对3个血清型的RA的攻毒保护率达70％ ～ 100％.证明该三价灭活疫苗具有良好的安全性免疫保护力,免疫保护期不少于9周.     

罗非鱼无乳链球菌LAMP快速检测方法的建立

针对无乳链球菌高度保守的表面免疫相关蛋白基因,采用环介导等温扩增技术(LAMP),设计4条特异性引物,优化反应体系,建立罗非鱼无乳链球菌快速诊断方法.研究结果表明,LAMP方法检测灵敏度达到30 CFU·m L-1,且对2株罗非鱼源无乳链球菌均能扩增出特异性片段,而对14株非无乳链球菌均未扩增出相应片段.建立的LAMP检测方法具有高度的特异性和灵敏性,反应在1 h内完成,为罗非鱼无乳链球菌病的快速诊断提供了一种重要的技术手段.     

三聚氰胺对吉富罗非鱼的急性毒性研究

采用接触、腹腔注射及口服3种致毒方式,对吉富罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)进行三聚氰胺的急性毒性研究.口服急性毒性实验中,在饲料中添加不同浓度的三聚氰胺,进行21d的吉富罗非鱼摄食养殖实验,实验鱼初体重为(55.00±0.05)g.实验结果表明:三聚氰胺溶解度较低,在接触实验中其水溶液没有表现出毒性,96LC50>3500mg/L;而在腹腔注射致毒方式下,三聚氰胺对吉富罗非鱼的半致死剂量LD50=1311.90mg/kg;LD5095%可信限为1169.06～1472.21mg/kg;在21d口服急性毒性实验中,添加三聚氰胺后不同程度地降低了吉富罗非鱼的摄食率和特定生长率,但对存活率和饲料系数均无显著影响.三聚氰胺对吉富罗非鱼21d的最大未观察到有害作用剂量(no-observed-adverse-effect-level,NOAEL)为31.00mg/(kg*d).     

尼罗罗非鱼IgT重链的蛋白表达及表达分析

IgT（Immunoglobulin T）作为新型免疫球蛋白在粘膜免疫中具有重要作用. 文中根据尼罗罗非鱼IgT基因序列构建原核表达载体获得IgT重组蛋白,相对分子量约75 kDa,并制备出效价较高的小鼠抗罗非鱼IgT的多克隆抗体. 荧光定量PCR检测证明：健康尼罗罗非鱼中IgT在多种组织中都有表达,其中脾脏、皮肤、肠和鳃中表达量相对较高. 无乳链球菌感染后,皮肤和头肾中IgT mRNA的相对表达量分别在12 h和4 d显著上调. 免疫组化结果显示：IgT蛋白在头肾和皮肤中均有少量分布,在无乳链球菌刺激后,在皮肤中出现大量分布. 以上结果表明:IgT在尼罗罗非鱼皮肤粘膜免疫中具有重要作用.     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗油乳佐剂的筛选及免疫效果评价

为了对比筛选出鸡传染性鼻炎(IC)三价灭活疫苗的最适油乳佐剂,使用三种不同的油乳佐剂制备了3批鸡传染性鼻炎(A型+B型+C型)三价灭活疫苗,并对疫苗的物理性状、安全性及免疫效力进行检测.结果 显示,三种佐剂制备的疫苗均为稳定的油包水乳剂,而佐剂3组的黏度(29.3 Pa.s)显著低于其余两种佐剂组(184.2 Pa.s...     

乳链球菌SB900肽聚糖对中国对虾免疫功能的影响

利用注射法研究了乳链球菌ＳＢ９００肽聚糖对中国对讷环境的影响。研究结果表明ＬＡＢＰＧ经肌肉注射后可激活中国对虾体内的细胞防御体系，对对虾血淋巴中的抗菌、溶菌、酚氧化酶和 氧化物歧化酶几种免疫相关因子具有不同程度的诱导作用。体外实验表明ＬＡＢＰＧ对酚氧化酶原具有一定的激活作用。表明利用ＰＧ提高对虾免疫系统的功能是一条可行的途径。     

不同低温条件下吉富罗非鱼的耐受性研究

应用室内人工降温,以0.5 ℃/2 h的降温方法研究吉富罗非鱼的低温耐受能力,分析比较不同低温条件下吉富罗非鱼的昏迷情况和死亡情况,评价其低温耐受性.结果表明:在8、9、10和11 ℃持续低温胁迫下,吉富罗非鱼的昏迷温度在8.9～10.5℃,半数昏迷温度为9.6℃左右;从开始出现昏迷到全部死亡的经历时间分别为14.5、18.5、24.5和28.5 h;昏迷维持时间与累计死亡率呈显著的线性相关,分别为:y=-0.0489x2+1.4330x-9.5078(R2=0.9999)、y=-0.0136x2+0.5024x-3.6385(R2=0.9649)、y=0.0038x2-0.0461x-0.1344(R2=0.9843)和y=-0.0034x2+0.2443x-3.2131(R2=0.9945).吉富罗非鱼的耐受性与时间和温度密切相关,其中8℃组耐受时间最短,11℃组最长.     

粤北地区鸡致病性大肠杆菌蜂胶佐剂疫苗的免疫试验

从粤北地区分离到的鸡致病性大肠杆菌中选择6株优势致病性大肠杆菌菌株做为制苗菌种，制备制苗菌液，按相同比例混合灭活，加蜂胶乙醇浸液为佐剂制备多价菌苗．安全试验结果证实，该灭活菌苗对20日龄肉仔鸡安全，试验鸡元不良反应；在5～10℃保存12个月，疫苗物理性状稳定．免疫效力试验结果：疫苗保护率为100％；接种20日龄雏鸡O．5ml／只，血凝试验检测结果为接种多价蜂胶灭活疫苗的试验鸡在免疫后第二周可检测出抗体，抗体滴度均数为3．10log2；免疫后第四周达到最高峰，抗体滴度均数为3．60log2；免疫后第五周抗体滴度开始下降，抗体滴度均数为2．10log2，但抗体滴度仍高于对照组（1．25log2）．在大肠杆菌感染鸡场进行的多批区域试验结果表明，该多价灭活疫苗安全，具有良好的保护作用．     

冀南地区PRRSV的流行病学调查及灭活苗的制备

为预防和控制猪繁殖与呼吸综合征在我国广泛流行,减少对养猪业带来的巨大经济损失,调查了2006年以来冀南地区16个县市猪繁殖与呼吸综合征的发病情况、流行规律,进行油乳剂灭活疫苗的研究,结果表明,自家制备的油乳剂灭活疫苗不能有效防治高致病性蓝耳病的爆发.     

广西斑点叉尾鮰源嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备

本研究针对广西地区分离到的致病性嗜水气单胞菌,开发区域定制化的灭活疫苗,以实现鱼病的有效预防和控制。首先,对斑点叉尾鮰源嗜水气单胞菌在LB培养基中的生长曲线,培养基的最适pH值,以及培养基中添加蔗糖对嗜水气单胞菌生长影响进行研究;随后探索嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备方法,并在细胞水平和斑点叉尾鮰活体水平上研究疫苗的安全性,开展疫苗对斑点叉尾鮰的免疫保护实验。结果表明嗜水气单胞菌浓度与菌液OD值间具有较好的线性关系,其回归方程为y=2E-10x+0.1399,R2=0.975 4。用于培养嗜水气单胞菌的LB培养基最适pH值为7.0～7.5,且在培养基中添加蔗糖能显著促进嗜水气单胞菌的生长。研究制备的嗜水气单胞菌灭活疫苗在细胞水平和鱼活体水平均安全无毒,且对斑点叉尾鮰的免疫保护率可达到75%。据此,本研究初步建立起广西斑点叉尾鮰源嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备工艺。     

尼罗罗非鱼IgM单抗的制备及IgM+B淋巴细胞吞噬能力的研究

采用免疫亲和层析方法纯化尼罗罗非鱼抗TNP特异性IgM,并以此为抗原免疫Babl/c小鼠进行单克隆抗体制备. 免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合成杂交瘤细胞,利用酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法(Western blot)和流式细胞术筛选获得两株抗IgM重链的单克隆抗体,分别命名为3B3和9D12. 纯化后的单克隆抗体3B3和9D12在1 mg/mL浓度下其抗体效价分别为740,741和359,712 units/mL. 利用制备的单抗结合激光共聚焦显微镜检测发现,膜结合型IgM位于B细胞膜表面(IgM+ B细胞). 流式细胞术检测尼罗罗非鱼IgM+ B细胞的免疫组织分布,发现IgM+ B细胞分布存在组织差异性,其中在外周血(PBL)所占比例最大,约为37.6%,其次是脾脏(SPL),占百分比33.7%,头肾(AK)占比例约为23.9%,而后肾(PK)占比例约为20%. IgM+ B细胞荧光微球的吞噬能力分析发现,IgM+ B细胞对0.5 m的荧光微球吞噬能力强于1 m. 另外,IgM+ B细胞的吞噬能力存在免疫组织差异性,其中对于0.5 m荧光微球的吞噬,PBL明显高于其他组织,而AK IgM+ B细胞对1 m荧光微球的吞噬能力最强. 以上结果表明,本研究成功制备了鼠抗尼罗罗非鱼IgM单抗工具,并利用其IgM单抗发现IgM+ B细胞具有吞噬能力且其吞噬能力存在组织差异性,表明IgM+ B细胞在先天性免疫中可能发挥重要作用.     

吉富罗非鱼不同家系的生长性状差异

以吉富品系尼罗罗非鱼为亲本,采用巢式配对法进行同质随机配对,配对252个家系,繁育获得106个家系,成功率为42.06％;通过标准化培育,构建了86个吉富罗非鱼全同胞家系和10个半同胞家系.选取22个不同家系进行同步的生长比较研究,结果表明:40、90、120及150日龄不同家系间平均体长、平均体质量的差异显著(P＜0...     

结核杆菌ESAT-6基因疫苗对结核杆菌感染小鼠的免疫保护效果研究

为研究结核杆菌ESAT-6基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果,将雌性C57BL／6N小鼠32只,随机分为4组,即结核杆菌ESAT-6基因疫苗组、BCG组、pcDNA3．1（＋）组和PBS组。取小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100：1、50：1、10：1进行CIL杀伤活性检测。用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z—N染色检查抗酸杆菌,观察陔疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明,结核杆菌ESAT-6基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,可诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-1分泌增加,IL-4分泌减少,CTL特异件活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻。