用差异显示反转录PCR银染技术研究小鼠前胃癌相关基因

目的:以N-亚硝基-肌氨酸乙酯(NSEE)作为诱变剂建立NIH小鼠前胃癌动物模型,研究小鼠前胃癌差异表达基因,探索细胞癌变的分子机理.方法:采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)、反向Northern点杂交、克隆、测序和生物信息学分析等方法,对其癌变组织中差异表达的基因进行系统的研究分析.结果:得到5条在小鼠前胃正常对照组织、癌变组织之间差异表达的cDNA片段.筛选后,对其中3个差异条带进行DNA序列测定,有1个与已知基因Tpt1高度同源,2个与同1基因片段AK085193.1高度同源.提示这2个基因与小鼠前胃癌的形成有关.     

银染差异显示方法的建立及其条件的优化

mRNA差异显示技术是辨析差异表达基因的强有力的工具。本实验旨在优化无同位素的银染差异显示方法。以总RNA为模板，反转录成cDNA，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用银染的方法显示cDNA条带，其结果为：RNA模板在2μg以上时，可以扩增出较多的条带，而低于1μg时条带数目减少；在38～40℃范围内，40℃扩增的条带多而清晰；优化银染程序。     

声波刺激对拟南芥基因表达的影响

运用银染mRNA逆转录差异显示(DDRT-PCR)技术,初步研究了声波刺激对拟南芥差异基因表达的影响.研究分离得到SA3、SG2-1、SG2-2、SG7-1、SG7-2、CA2共6个差异表达基因片段,进一步运用Northern点杂交确定SA3、CA2、SG7-1为阳性片段,其中SA3片段属于声波刺激特异表达基因, SG7-1片段属于声波刺激增强表达基因,CA2片段属于声波刺激抑制表达基因.研究结果表明植物在基因水平对声波刺激具有响应,为下一步探索植物响应声波应力的分子生物学调控机理奠定了基础.     

白粉菌诱导的小麦品种Brock的差异表达基因解析

为了解抗病小麦品种Brock对白粉菌的抗性机制,采用m RNA差异显示技术(DDRT-PCR)和反向Northern杂交技术分析小麦Brock在白粉菌诱导下的差异表达基因.对照组共获得5 072个片段,诱导组获得5 366个片段,反向Northern杂交筛选后,获得94个差异表达片段.基因测序和Blast比对后,共有71个片段得到功能注释,涉及抗病防御相关基因、能量代谢相关基因、转录因子、次级代谢相关基因以及信号转导基因等.选取与RPP13同源的片段7和与MYB44同源的片段10进行半定量表达模式分析,发现白粉菌诱导后这2个基因的表达明显上调,在染菌8 h后达到峰值,表明二者可能参与Brock白粉菌侵染的早期应答反应.     

应用cDNA微阵列芯片筛选胃癌转移相关基因的初步研究

采用cDNA微阵列技术建立胃癌原发灶和淋巴结转移灶基因表达谱,识别和克隆胃癌转移相关基因。用含10000个已知基因和7000个EST的cDNA微阵列分析胃癌原发灶和淋巴结转移灶表达谱的变化,利用生物信息学分析差异表达基因, RT-PCR和反向Northern点杂交验证cDNA微阵列结果。发现2倍以上的差异表达基因601个,其中淋巴结转移灶中表达上调527个,表达下调74个;2倍以上的差异EST 71个,其中淋巴转移灶中表达上调62个,表达下调9个。在胃癌原发灶中,与细胞免疫、发育、信号转导功能相关基因存在高表达;而在淋巴结转移灶中,与细胞生长、细胞周期、细胞运动和粘附功能相关基因存在高表达。RT-PCR和反向Northern点杂交结果进一步证实carbonic anhydraseⅡ、IGFBP-4基因高表达与胃癌转移相关。通过分析胃癌原发灶和淋巴结转移灶表达谱的变化,发现一些与胃癌转移相关的基因和EST,为进一步寻找和克隆胃癌转移相关基因提供研究线索。     

以mRNA差异显示法分离牙鲆白化相关基因的初步研究

以正常和白化牙鲆表皮组织总RNA为模板,用Oligo d(T)13M(M分别为A、C、G)3种锚定引物和26种差异显示随机引物组合进行差异显示,PAGE凝胶电泳后,用新型高灵敏度核酸荧光染料SYBR GREEN I显示差异DNA条带,得到区分度较好的差异表达图谱,共分离49条牙鲆白化相关DNA片段,片段长度260～800bp左右,经克隆测序后将可作为新的ESTs进行同源序列比较.     

mRNA差异显示法筛选和克隆东亚飞蝗抗药性相关基因

筛选和克隆东亚飞蝗抗药性相关基因.采用mRNA差异显示法(mRNA diffFerential display PCR,DD-PCR),对比了东亚飞蝗在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导前后,基因表达发生的变化.对差异片段进行了回收,克隆、测序,Northern点杂交验证以及序列分析和同源性比较.东亚飞蝗在受到氯氰菊酯杀虫剂的诱导前后,存在明显的基因表达差异,发现差异表达条带9条,对9条差异表达条带进行克隆、测序,经序列分析和同源性比较和RNA点杂交验证,表明确认其中1条带与东亚飞蝗的抗药性有关.东亚飞蝗的mRNA差异显示证明,该EST序列可能在抗药的发生发展中具有一定的作用.     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)和绿头野鸭(Anas platyrhynchos)卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA(同源性为96%)、褐家鼠睾丸cDNA(同源性为83%)有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

晚期胃癌中的肿瘤异质性表达与侵袭转移的相关性研究

应用免疫组化和突变分析方法,分析晚期胃癌原发灶和转移灶nm23,S100A4和p53的表达差异,探讨肿瘤内部异质性在胃癌转移发生中的意义。结果发现转移抑制基因nm23在转移灶中的表达显著上调,转移促进基因S100A4在转移灶中的表达显著下调,癌基因p53在两者中的表达和突变没有明显差异。nm23在原发瘤中的表达下调以及S100A4和p53的过度表达与胃癌的高侵袭性显著相关。数据显示:nm23和S100A4在胃癌的转移中发挥作用,而p53是胃癌发生的一个晚期事件。     

nm23转移抑制基因表达在结直肠癌淋巴结转移中的意义

人类肿瘤转移抑制基因nm23定位于17号染色体,有H_1和H_2两个亚型,编码17KD蛋白质,氨基酸排列顺序与二磷酸核苷激酶(NDPK)高度同源。已发现nm23基因的等位基因缺失,突变和低表达与多种人类肿瘤转移相关。nm23基因产物的表达与结直肠癌转移的关系及意义尚无一致意见。本文以结直肠癌根治性手术后全数淋巴结检查为基础(平均每例46.25个),应用S—P技术检测20例结直肠癌nm23基因产物的表达情况。结果表明,nm23基因产物的表达与淋巴结转移个数之间呈明显负相关(r=-16.58,P<0.01);而在有无淋巴结转移之间,差异无显著性(P>0.05)。我们认为:结直肠癌有淋巴结转移时,nm23基因产物的表达情况有助于判断转移的程度,而对估计有否淋巴结转移多方面的意义不大。     

RhoE促进胃癌转移及其分子机制

摘要：目的 探讨RhoE对胃癌转移的影响及可能的机制。方法 Western Blot(WB)和免疫组织化学检测RhoE蛋白在胃癌组织中的表达;WB,半定量PCR检测RhoE 蛋白和mRNA在转移潜能不同的胃癌细胞系中的表达;利用RhoE的正义表达载体稳定转染胃癌细胞系SGC7901,通过迁移实验、侵袭实验检测其对胃癌细胞体外迁移、侵袭能力的影响。WB检测改变胃癌细胞中RhoE表达后基质金属蛋白酶（MMP）表达变化。结果 RhoE蛋白在胃癌组织和细胞系中的表达与胃癌转移相关联;上调RhoE表达能促进胃癌细胞的体外迁移能力和侵袭能力MMP9表达也随之上调。结论 本实验率先证实RhoE能够促进胃癌转移,这一作用可能是通过上调MMP9实现的。     

基因芯片癌与癌旁组织分析中药品混合对结果的影响

基因芯片技术已经广泛地应用到生物科学与医学研究的多个领域中.由于实验费用的制约,在使用芯片数目较少的情况下,一些研究者倾向于把经过同一种处理的多个个体的RNA进行混合,希望能消除个体差异.但应用一个研究肿瘤的具体例子,比较单个个体与多个个体的RNA混合后得到的基因芯片的结果表明,多个样品的RNA混合后得到的结果和单个样品得到的结果,无论从正确率、假阳性、假阴性来比较,在统计学上都没有明显差异,因此：结合多个因素考虑,建议进行基因芯片分析的RNA样品不用进行混合.     

32例肿瘤组织中p53基因突变的PCR-SSCP、银染色检测

目的　检测肿瘤组织中 p5 3基因的突变率 ,探索其在肿瘤发展过程中的作用 .建立PCR SSCP检测 p5 3突变的常规方法 .方法　检测 32例癌组织和癌旁组织 .用盐沉淀制备样品DNA ,以p5 3基因exon7设计引物 ,用PCR SSCP结合银染色显示结果 .结果　 32例肿瘤标本检出阳性 9例 ,阳性率 2 8.1% .4例癌组织和癌旁组织均为阳性 .其中 2 2例胃癌 ,检出 4例阳性 (占 18.2 % ) ,双阳性者 2例 .结论　p5 3基因突变在肿瘤中具有普遍性 ,癌组织和癌旁组织双阳性者 ,与肿瘤的扩散有关 .该检测方法简便易行 ,有助于对 p5 3基因突变的扫描检测 .     

Cloning and expression analysis of MBLL cDNA

The mbl (muscleblind) gene of Drosophila encodes a nuclear protein which contains two Cys3His motifs. The mutation of mbl gene will disturb the differentiation of all the Drosophila's photoreceptors. Primers have been designed according to human EST086139, which is highly homologous to mbl gene. Human fetal brain cDNA library has been screened and a novel cDNA clone has been obtained. The 2595 bp cDNA, designated MBLL (muscleblind-like), contains an open reading frame which encodes 255 amino acids and has 4 Cys3His motifs (GenBank Acc. AF061261). The amino acids sequence shares high homology to Drosophila's mbl. The Northern blot and RNA dot blot hybridization of 43 human adult tissues and 7 fetal tissues show that MBLL is a widely expressed gene, but the expression amounts differ in these tissues.     

小鼠噬菌体抗体库的构建和N-肽结合单链抗体的筛选

成功构建一库容量为1.7×10⁸的小鼠噬菌体抗体库,并从中淘选出对N-肽有结合活性的单链抗体。首先从未免疫小鼠的脾脏中提取总RNA,分离出mRNA,经逆转录合成其总cDNA。随后通过PCR分别扩增出抗体重链和轻链可变区V_H、V_L的基因片断,再经重组PCR将两片断由一编码(Gly₄Ser)₃十五肽的接头连在一起,并克隆到噬菌质粒pCANTAB 5E中,电击转化大肠杆菌TG1。经辅助噬菌体M13KO7超感染回收全部重组噬菌体,此即噬菌体抗体库。N-肽是一种新发现的神经肽,其N端与阿片肽高度同源,可与阿片肽受体相互作用。对其研究可能有助于了解成瘾机制和有临床应用价值。将生物素化的N-肽与抗体库相互作用,用偶联有链霉亲和素的磁珠富集与N-肽结合的重组噬菌体,经四轮淘选,得到亲和力较高的单链抗体。     

CRTC1在食管癌中的表达及与临床病理的关系

探讨CREB转录共激活因子1（CRTC1）在食管癌组织与癌旁组织中的转录水平和翻译水平变化,及其变化与临床病理的关系。收集25例食管癌鳞癌患者的癌组织及与之配对的癌旁组织,通过qRT-PCR检测CRTC1的mRNA水平,western blot检测CRTC1的蛋白水平。在食管癌中,CRTC1蛋白表达低于癌旁组,而mRNA水平高于癌旁组;CRTC1在转录水平上与肿瘤位置和淋巴结转移有关。说明：CRTC1在食管癌中存在异常表达,CRTC1的mRNA有望用于食管癌诊断及淋巴结转移评估。     

从福尔马林固定的癌组织中提取RNA的方法

目的:寻求从福尔马林固定的癌组织中提取RNA的合理方法.方法:运用Trizol法从福尔马林固定的胃癌组织中提取RNA,用分光光度计测定RNA的产量和纯度;通过RT-PCR对不同长度的管家基因-actin进行扩增.结果:100 bp和300 bp的-actin均能顺利扩增出特异性条带,500 bp的-actin未能扩增.结论:用Trizol法从福尔马林固定的癌组织中提取RNA是可行的;进行RT-PCR时应尽量设计小片段引物(100~300 bp)以获得更好的扩增效果.