过表达醛脱氢酶对Klebsiella pneumoniae合成3-羟基丙酸的影响

克隆了肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）及大肠杆菌（Escherichia coli）各自的醛脱氢酶基因puuC和aldH,获得了重组肺炎克雷伯氏菌K.p(pET-PK-puuC)和K.p(pET-PK-aldH),这两株菌均能以甘油为唯一碳源生产3-羟基丙酸（3-HP）。发酵实验结果显示K.p(pET-PK-puuC)的甘油转化率和单位菌体产量与野生菌相比分别提高了135%和18%;K.p(pET-PK-aldH)的3-HP产量达1.43g/L,是K.p(pET-PK-puuC)的1.8倍,比野生菌提高了81%,甘油转化率和单位菌体产量比野生菌分别提高了150%和88%。     

肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD~+再生的耦合

在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中超表达内源甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC,同时引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1,得到耦合3-羟基丙酸(3-HP)合成与NAD+再生的重组菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h时3-HP产量达到1.45g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD+

在肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中超表达内源甘油脱水酶基因 dhaB 和醛脱氢酶基因 puuC,同时引入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的3-磷酸甘油脱氢酶基因 GPD1,得到耦合3-羟基丙酸（3-HP）合成与NAD⁺再生的重组菌 K.p (pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h 时3-HP产量达到1.45 g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆、表达及其对宿主菌生长的影响

辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(Pdu P)是以甘油为底物催化合成聚3-羟基丙酸的关键酶。本研究从鼠伤寒沙门氏菌基因组中PCR扩增了pdu P基因,构建表达载体后转化肺炎克雷伯氏菌,得到重组菌K.p(p ET-pk-pdu P)。SDS-PAGE显示Pdu P实现了高效表达。生长曲线表明重组菌延迟进入平稳期,生物量较空质粒对照菌提高了24.68%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的产量分别达到16.58 g/L和15.68 g/L,甘油转化率比空质粒对照菌和原代菌分别提高了40.62%和34.02%。上述结果表明,过表达pdu P重排了代谢流量,促进了菌体生长。     

透明颤菌血红蛋白基因在产TRAIL蛋白大肠杆菌中的克隆表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产TRA IL过程中的供氧矛盾,提高菌体的发酵密度,在大肠杆菌中引入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。聚合酶链反应(PCR)检验和CO差光谱法检验表明:vgb基因能够在C 600(pBV 220-TRA IL)中表达并受溶氧调控,重组菌CTV具有良好的遗传稳定性。3.7 L发酵罐实验表明:在同样的发酵条件下,含vgb基因的重组菌CTV的最高菌体密度为对照菌的1.64倍,达到50.6 g/L,乙酸积累为对照菌的55.6%,TRA IL蛋白产量提高了70%,达到2.8 g/L。     

产甘油重组大肠杆菌的构建及其耐高渗透压性能的测定

克隆了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 中的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酯酶基因,通过融合PCR构建了双基因共表达载体,将酵母细胞内应答渗透压变化的甘油合成途径引入大肠杆菌（Escherichia coli）。以葡萄糖为底物对重组大肠杆菌进行摇瓶发酵培养,该重组菌的甘油产量为1g/L。渗透压胁迫测试证明该重组菌的耐渗透压性能较出发菌株有明显提高。     

基于sigma因子全局代谢扰动提高克雷伯肺炎杆菌的3-羟基丙酸产量

利用易错PCR技术构建了全局转录机器工程（gTME）关键元件σ因子（rpoD基因）的突变文库,连接至表达载体,电转化K.pneumoniae DSM 2026,并且从大量阳性克隆中筛选出一株3-羟基丙酸（3-HP）高产菌。初步发酵试验表明,该携带突变rpoD基因的工程菌能高效利用甘油生产3-HP,产量达到4.49g/L,比携带野生型rpoD基因的对照菌提高242.75%,甘油转化率、生产强度分别提高了832.50%、239.39%。     

氧化葡萄糖酸杆菌驯化选育及其产二羟丙酮

通过梯度增加种子培养基中甘油浓度驯化氧化葡萄糖酸杆菌（Cluconobater oxydans）,有效地提高了该菌对甘油的耐受性,菌株产二羟丙酮水平比驯化前提高了29%,在此基础上,采用单因素试验,对其发酵工艺进行优化。考察甘油质量浓度、酵母膏质量浓度、CaCO₃质量浓度、接种量对发酵的影响,结果显示最佳工艺条件为:甘油质量浓度为60 g/L,酵母膏质量浓度为5 g/L,CaCO₃质量浓度为10 g/L,接种量4%,在此条件下,经72 h摇瓶发酵甘油转化率达96%,二羟丙酮产量可达57.4 g/L,7.5 L发酵罐分批发酵54 h时甘油转化率达97%,二羟丙酮产量可达58.2 g/L。     

敲除iclR基因对大肠杆菌发酵L–色氨酸的影响

为了研究敲除icl R基因对大肠杆菌(Escherichia coli)发酵L–色氨酸的影响,以L–色氨酸工程菌大肠杆菌TRTH为出发菌株,利用Red重组技术构建了icl R基因(编码乙醛酸操纵子阻遏蛋白)缺失菌株TRTHΔicl R.摇瓶发酵实验结果显示:TRTH icl R的L–色氨酸产量和糖酸转化率分别达到(6.52±0.46)g/L和13.17%,,比原菌的分别提高了21.86%,和22.85%,;乙酸累积量为6.82,g/L,比原菌的降低了37.63%.30,L发酵罐发酵实验结果显示:TRTH icl R的L–色氨酸产量及糖酸转化率分别达到(13.01±1.05)g/L和6.51%,,比原菌的下降了60.34%,和68.27%,;乙酸累积量为18.21,g/L,比原菌的增加了33.42%.结果表明:在摇瓶条件下,重组菌株生物量较出发菌株高,代谢流分配适合L–色氨酸积累;但在发酵罐条件下,乙醛酸循环的增强导致重组菌株供能不足和乙酸的过多积累,最终使得生物量不足以及L–色氨酸产量下降.     

过表达生长相关基因对肺炎克雷伯氏菌甘油代谢的影响

在肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中过表达生长调控基因,以携带空载体的重组菌为对照,筛选生物量高且目标产物增加的重组菌。摇瓶发酵 24h后测定各重组菌的生物量、甘油消耗及代谢物产量。研究发现,与携带空载体的重组菌相比,过表达编码核糖ABC转运酶的rbsC基因可使生物量和甘油转化率分别提高16.08%和24.69%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇产量分别提高39.59%和19.79%;过表达tRNA核苷酸转移酶基因cca可使生物量和甘油转化率分别提高7.17%和19.16%,1,3-丙二醇和2,3-丁二醇产量分别提高36.24%和13.39%。研究结果表明刺激细菌生长可望促进目标产物的积累。     

管囊酵母的诱变育种及甜高粱渣水解液发酵

对管囊酵母1771进行硫酸二乙酯(DES)与紫外线(UV)复合诱变,筛选得到一株菌DU-13,其糖醇转化率较出发菌株提高28.7%。用DU-13菌株在甜高粱渣酸水解液和发酵培养基中进行发酵,乙醇产量分别为3.5g/L和7.4g/L;转化率分别为0.173g/g和0.250g/g,水解液发酵效果不如发酵培养基。在甜高粱渣酸水解液中添加营养物质,并设计正交实验优化添加方案。将优化水解液在相同条件下利用DU-13菌株进行发酵,结果表明优化水解液发酵效果优于发酵培养基和水解液：乙醇产量为13.5g/L,转化率为0.378g/g。     

产菊酯降解酶重组菌的高密度发酵工艺优化

为提高菊酯降解酶的产量,利用单因素和正交实验法对重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sys410的发酵培养基组成和发酵条件进行优化。结果显示最优培养基含有20.0 g·L-1甘油、20.0 g·L-1酵母粉、8.0 g·L-1硫酸铵、100.0 mmol·L-1磷酸盐、5.0 mmol·L-1硫酸镁,以及1.5 m L·L-1的微量元素;发酵条件为装液量50 m L/250 m L、初始培养基pH 7.0、接种量2%,接种培养8 h后乳糖诱导6 h。在7.5 L发酵罐上,使用低浓度碳氮源进行培养,前期恒速补料,对数中后期进行乳糖诱导,后期恒溶氧补料,最终菌体密度和酶活力分别为142.6和3 105.1 U·m L-1,较摇瓶发酵分别提高13.7倍和31.9倍。发酵液经破碎和冷冻干燥后酶活力达到119 426.9 U·g-1,且该酶对菊酯的降解率高于95%。     

假单胞菌B5生物合成邻苯二酚的研究

以假单胞菌B5菌株(实验室筛选)为实验菌株 ,完成了游离细胞发酵条件优化和发酵保护剂甘油最适用量的研究。在 6g/L的苯甲酸钠和 1.1g/L培养基上30℃培养 24h ,邻苯二酚(catechol)产量达到 2.5g/L ,分子水平转化率为 52.3%;同时进行细胞固定化材料、固定化条件和固定化发酵条件的实验。以 1.5%壳聚糖和 0.1%的海藻酸钙为固定化介质 ,0. 1%的戊二醛交联制备得到的固定化细胞成球形 ,直径约为 2.5mm ,在苯甲酸钠 (6g/L)培养基中可连续批次发酵 12次 ,邻苯二酚平均产量约为每批次 1.5g/L。     

budC敲除及ldhA过表达对Klebsiella pneumoniae合成D-乳酸的影响

为了提高K. pneumoniae中D-乳酸的合成效率,本文以BUD和LDH为改造目标,扩增丁二醇脱氢酶基因budC,并在其中插入四环素抗性基因tet,构建了基因敲除载体pTBT,转化K. pneumoniae,利用同源重组技术,敲除K. pneumoniae染色体上的budC基因,得到重组菌K. pneumonia B-;在此基础上,构建了表达载体pKP-ldhA,转化K. pneumoniae B-,过量表达乳酸脱氢酶基因ldhA,得到重组菌K. pneumoniae B-L+。摇瓶发酵结果显示,重组菌K. pneumoniae B-L+的丁二醇合成浓度比原始菌降低了90%以上,D-乳酸合成浓度比K. pneumoniae B-和原始菌分别提高了77.1%和41.4%,发酵罐实验D-乳酸产量68.4g/L,转化率0.78,生产强度1.22g/(L·h)。结果表明,敲除budC及过表达ldhA有利于改善克雷伯肺炎杆菌中D-乳酸的合成。     

大肠杆菌表达高性能融合鱿鱼环齿-类弹性蛋白的发酵优化

为了实现重组蛋白SRT-ELP36在大肠杆菌中的高效表达,利用携带重组蛋白SRTELP36基因的pET-25b(+)表达载体,分别在摇瓶和5 L发酵罐上进行了发酵条件优化,并在50 L发酵罐中进行放大验证。经转化表达质粒后,宿主菌BL21(DE3)的菌体生长和蛋白体积产量均高于BLR(DE3),可用于蛋白SRT-ELP36表达。摇瓶发酵条件优化结果表明,TB(Terrific Broth)培养基、装液比(装液量与摇瓶体积之比)为5%、诱导温度为37℃、对数生长结束期添加0.5 mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂,菌体最高OD₆₀₀(波长600 nm处的吸光值)达到22.3,最高蛋白体积产量达0.60 g/L。在5 L发酵罐中进行补料分批培养条件优化,在OD₆₀₀为35时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG启动诱导,并控制过程菌体氧消耗速率(OUR)为(180±5) mmol/(L·h),菌体的最高OD₆₀₀和蛋白体积产量分别达到了88、1.85 g/L,单位菌体蛋白产量为70 mg/g。在...     

乙酸对1，3-丙二醇发酵的影响

考察了克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中，乙酸对发酵过程的影响。结果表明，在发酵初始培养基中加入微量的乙酸能够提高1，3－丙二醇的产量，但乙酸的添加会影响菌体生长，造成发酵液的菌体吸光度A下降。通过实验确定了乙酸的最优添加质量浓度为0.6g/L，此时1,3-丙二醇质量浓度为8.46g/L，转化率为0.62；在此浓度乙酸初始培养基中添加1.2g/L葡萄糖作为辅助底物将甘油转化率提高到0.66。     

克雷伯氏菌产物耐受突变株的发酵工艺

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是1,3-丙二醇(1,3-PD)生产菌。研究了经60Co诱变获得的一株产物耐受突变株KpA6010进行了发酵初期供氧时间、供氧与否和发酵过程中后期维持甘油浓度对1,3-PD生产及副产物形成影响。结果显示,采取全厌氧发酵和中后期维持甘油质量浓度20 g/L的工艺对1,3-PD生产有利。5 L罐全程厌氧补料分批培养结果表明,1,3-PD的产量、摩尔得率和生产强度分别达到70.81 g/L、0.649和2.083 g/(L.h),较出发菌分别提高了54.3%、52.0%和50.7%。     

新建产PHB基因工程菌VG1(pTU14)的碳源代谢

为解决聚 β-羟基丁酸酯 (PHB)生产过程中的高成本问题 ,构建了具有高溶氧利用能力及可自动裂解破壁的PHB高产基因工程菌 VG1(p TU14)。对该重组菌的葡萄糖耐受能力、乙酸的辅助同化作用及较廉价的淀粉水解液替代葡萄糖的可行性等进行了研究。该重组菌可以在初糖浓度2 0 0 g/ L 的培养基中良好生长 ;无机氮源乙酸铵可同时提供乙酸作为辅助碳源 ;采用淀粉水解液可以完全替代葡萄糖 ,发酵结束时菌体生长和 PHB积累均提高 ,还原糖利用率也可达到 99%以上。     

利用克雷伯氏菌进行同步糖化发酵产氢的研究

氢作为一种清洁的能源引起了人们的普遍重视.实验以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HP1为产氢菌株,以稻草粉为产氢底物,进行同步糖化发酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation,SSF)产氢.对影响同步糖化发酵产氢的单因子进行试验,选取对氢产率影响较大的因子:温度、pH、纤维素酶用量等进行L9(34)正交试验.结果表明同步糖化发酵产氢的最佳条件为:温度40℃,pH6.5,纤维素酶用量为20FPAU/g稻草粉,摇床转速100r/min,发酵时间42h.在该条件下的最大氢产率为110.6mL/g稻草粉,稻草粉的氢转化率为22%.进行了10L放大发酵产氢试验,最大氢产率为122.3mL/g稻草粉,氢转化率为24.3%.与分步糖化发酵(Separate Hydrolysis and Fermentation,SHF)产氢相比,氢产率提高34.4%.研究表明,利用同步糖化发酵工艺可以提高生物制氢的产量和得率.     

响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基

目的 借助于MINITAB统计学软件,采用Plackett-Burman设计和响应面优化法对基因工程菌Escherichia coli BL21发酵生产类人胶原蛋白的原始培养基进行优化研究.方法 首先利用 Plackett-Burman设计筛选出对类人胶原蛋白产量影响显著的3个因素,即葡萄糖甘油1:4混合碳源、酵母粉和硫酸铵.在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,找到后续实验的中心点.再利用Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,确定主要影响因素的最佳水平.结果 优化后的3种主要影响成分为葡萄糖甘油1:4,混合碳源12.24 g/L,硫酸铵7.12 g/L,酵母粉5.53g/L.结论 方程拟合良好,优化后的培养基发酵产量经摇瓶和发酵罐验证,产量分别为5.91g/L和6.12g/L,较优化前分别提高了306%和296%.