甜菜坏死黄脉病毒RNA5对病毒致病性的影响

利用甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV) RNA5全长侵染性cDNA克隆体外转录获得的RNA5体外转录物, 与只含有RNA1, 2以及RNA1, 2和3的两个BNYVV突变株BNYVV-Hu0和BNYVV-Hu3的RNAs分别混合, 并接种于寄主植物番杏(Tetragonia expansa)和甜菜(Beta vulgaris L). 结果表明, RNA5是BNYVV中除RNA3以外的另一个病毒致病性相关分子, 它的存在能够提高病毒的侵染效率和在寄主体内的积累水平, 并与RNA3协同作用, 导致病毒侵染后的症状表现加重.     

λ噬菌体DNA复制起始的转录激活:体外系统的研究

通过构建重组质粒 ,将λ噬菌体DNA复制原点置于T7启动子控制之下 ,建立了依赖T7RNA聚合酶转录激活的λDNA复制体外纯酶系统 .这一系统的建立为阐明λDNA复制起始的转录激活的分子机理提供了条件 .同时表明 ,λDNA复制起始的转录激活不依赖大肠杆菌RNA聚合酶与复制蛋白之间的特异相互作用 .     

口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长基因组感染性克隆的构建

以构建的口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长cDNA为模板, 使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录, 得到病毒RNA. 用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞, 可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应. 对收获的病毒分别用RT-PCR, 乳鼠毒力试验以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定, 结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒. 同时用空斑实验法观察了拯救病毒及其亲本毒株的生长特性, 结果表明二者在致病性上没有明显差异, 这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础.     

酵母RNA聚合酶Ⅱ体外转录亚病毒RNA的研究

真核细胞的依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ在无蛋白质因子存在的条件下,在体外不能忠实转录DNA。然而,令人惊异的是植物来源的RNA聚合酶Ⅱ能在体外忠实转录类病毒RNA,产生全链长的产物。这一发现意味着类病毒RNA能提供类似启动子的位点,以便与RNA聚合酶发生特异性的相互作用,从而正确地起始转录。毫无疑问,这一系统将是了解真核细胞RNA聚合酶Ⅱ所催化的体外转录机制的理想模型之一。     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

最初的酶是蛋白质,还是核酸?

生命由三个要素构成。第一,生命同外界之间具有境界膜。生命存在于为这境界膜所隔离的微小环境下。现在的生物细胞膜组成以脂质和蛋白质为主。第二,生命具有自我复制能力,即具有产生的后代同自己相似的自我保存能力,这功能基于DNA携带的遗传信息。第三,生命具有自我维持功能,换句话说,就是能进行代谢活动。在现在的生物中,合成核酸和蛋白质的顺序是: DNA 转录 RNA 转译蛋白质这就是著名的中心法则。现有的生物都以这样的顺序从DNA生物合成(转录)RNA的,但最近有人认为在最初生命诞生时不用DNA、而是以RNA作为遗传信息体的。其根据有以下几个方面:1.各种RNA(如mRNA、rRNA、tRNA等)同蛋白质的生物合成关系密切,同DNA则无直接联系;2.DNA是RNA糖部分2’-OH的还原,就是说可以从RNA进行生物合成;3.DNA的生物合成过程中需要短链RNA引物;4.小病毒的遗传物质是RNA,大病毒是DNA;5.RNA病毒的逆转录酶也许是留有从RNA到DNA过渡期痕迹的化石;6.NAD和FAD那样的RNA诱导体作为辅酶参与酶作用;7.在前生物合成系统中,低聚核糖核苷酸比低聚脱氧核糖核苷酸更容易被合成;8.在RNA中有的具有酶作用,等等。     

家蚕细胞质多角体病毒复制机制的研究

家蚕细胞质多角体病毒(CPV)用凝胶柱层析的方法代替氯化铯密度梯度超离心可以方便的大量地进行纯化,这样制备的CPV表现较高的感染力和RNA多聚酶活力。CPV的mRNA在体外条件下用病毒粒子所带的RNA多聚酶转录合成可达毫克水平。CPV的mRNA可以方便的从反应液中分离出来,于聚丙烯酰胺凝胶电泳分为九条带。小麦胚无细胞系统在CPV mRNA的存在下翻译合成的蛋白质,在对流免疫电泳中与CPV抗血清交叉反应形成沉淀。这些     

利用反向遗传学技术获得适应RK13细胞的兔出血症病毒

在前期构建的兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)全长cDNA分子的基础上, 利用SP6 RNA聚合酶系统, 在体外转录合成了病毒RNA. 用转染试剂将病毒RNA导入RK13细胞, 12 h后可见明显致细胞病变(CPE), 用间接免疫荧光方法在RK13细胞中检测到了病毒抗原的产生. 将收获的细胞培养物再次接种RK13细胞, 仍然能产生明显病变. 大量收取细胞培养物, 经差速离心法纯化病毒后, 在电子显微镜下可观察到RHD病毒粒子. 结果表明, 利用反向遗传学技术获得了可适应于RK13培养的RHDV, 为将来研究RHDV的分子致病机理和新型疫苗等提供了有利的工具.     

由标准强毒F114株全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒

通过RT-PCR获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)强毒株cF114株(中国标准强毒F114株经PK-15细胞增殖)全长基因组cDNA并测序. 与已知其他几株CSFV代表毒株F114, Brescia, Alfort和C株的核苷酸同源性分别为99.41%, 96.80%, 86.03%和95.70%; 氨基酸同源性分别为99.28%, 98.54%, 93.33%和97.41%. 将获得的各基因片段按病毒基因组顺序连接成全长cDNA, 插入pMC18质粒SalⅠ/ XbaⅠ之间, 得到含病毒全长基因组的重组质粒pMC12297. 用T7 RNA聚合酶进行体外转录, 转录出的RNA转染PK-15细胞, 细胞上清液经扩增后, 测定上清液中病毒滴度. 质粒来源的CSFV(vM12297)在抗原反应性和复制能力方面与父代病毒相似. 将疫苗毒C株囊膜蛋白基因E01和E2分别替换到pMC12297相应位置, 获得嵌合体基因组质粒pM/CE01和pM/CE2, 体外恢复获得嵌合体病毒vM/CE01和vM/CE2. 两种嵌合体病毒均能感染PK-15, SK-6和原代猪睾丸细胞, 间接免疫荧光检测显示较vM12297弱, 在PK-15细胞上滴度达到8×10 F-PFU/mL. 这一工作为进一步研究和探讨CSFV增殖与致弱的机理提供了重要的实验和理论资料.     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

宿主因子参与HBV cccDNA形成和转录

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起乙肝的病原体. HBV基因组是一个不完全双链环状DNA(relaxed circular DNA, RC-DNA).当HBV在宿主细胞中复制时,首先RC-DNA需要转化为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, ccc DNA),后者作为HBV的转录模板,产生病毒的亚基因组和各种m RNA.其中,pg RNA作为逆转录模板逆转录负链DNA,继而合成正链DNA,最后组装成新的RC-DNA. ccc DNA的存在是干扰素(IFNs)、核苷类似物(NAs)等药物无法彻底消除乙肝抗原、治愈乙肝的重要原因. HBV ccc DNA的形成和转录过程受到许多宿主因子的调控,本文从乙肝病毒的感染和复制特征出发,总结了在各个过程中参与HBV ccc DNA形成和转录的宿主因子,对有关HBV ccc DNA形成的具体过程以及调控机制的研究具有一定指导意义.     

丙肝病毒全基因组cDNA克隆侵染细胞培养体系的建立

以含有丙肝病毒全基因组cDNA的重组质粒(pHCV)为材料, 通过基因转染、重组痘病毒辅助使之在HeLa细胞中表达HCV病毒体, 建立了一种新的HCV体外细胞培养系统. 采用RT-PCR, 荧光定量RT-PCR, 链特异性RT-PCR, 免疫印迹, 免疫电子显微镜和电子显微镜负染技术跟踪检测HCV的增殖效率, 结果显示, 该培养体系中有HCV正链RNA的合成和HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达, 并组装成直径约47 nm的HCV病毒体, 病毒体可被偶联有胶体金的抗HCV结构蛋白E2的单抗标记; 该体系产生的HCV病毒体滴度达107基因拷贝/mL, 远远高于病人血清中的HCV基因拷贝数, 也高于迄今报道的任何一种HCV细胞培养体系的病毒滴度. 检测结果证明, 转染细胞裂解上清中的HCV病毒体可以感染肝癌细胞系Huh7, 并在感染细胞中增殖和合成负链RNA中间体, 病毒滴度达106基因拷贝/mL.     

猪水泡病病毒HK/70株全长cDNA分子克隆感染性的鉴定

为了鉴定猪水泡病病毒(SVDV) HK/70株的全长cDNA分子的感染性, 以所构建的SVDV HK/70株的全长cDNA分子为模板, 应用T7 RNA聚合酶系统在体外进行转录, 将获得的RNA用脂质体转染法导入IBRS-2细胞, 传代培养, 观察到典型的SVDV致细胞病变效应. 反向血凝鉴定、间接免疫荧光、RT-PCR及序列测定结果表明, 从猪水泡病病毒全长cDNA拯救出了猪水泡病病毒(pSVDV). 用电子显微镜观察了pSVDV的形态, 测定了pSVDV的TCID₅₀和LD₅₀, 并与亲本毒进行了比较, 结果显示, pSVDV与亲本毒的毒力差别不显著. 结果表明, 猪SVDV HK/70的感染性cDNA克隆已经成功构建, 为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.     

新型冠状病毒RNA标准物质

研制了一种新型冠状病毒(coronavirus, SARS-CoV-2)体外转录RNA标准物质,用于SARS-CoV-2病毒RNA检测的量值溯源.目标基因范围涵盖已公布的SARS-CoV-2病毒检测的3个主要靶标基因:核壳蛋白N基因全长(基因组坐标:28274-29533, GenBank:MT027064.1)、包膜蛋白E基因全长(基因组坐标:26245-26472, GenBank:MT027064.1)、开放阅读框1ab(ORF1ab)基因片段(基因组坐标:13321-15540, GenBank:MT027064.1).通过采用数字聚合酶链式反应(digital PCR, dPCR)方法进行多实验室联合定值,确定了该标准物质的量值为N、E和ORF1ab基因的拷贝数浓度.研究结果表明,该RNA标准物质量值可靠,均匀性良好,稳定性可满足运输要求.进一步地,通过在临床检验、多家不同原理的病毒检测试剂盒生产企业、方法开发实验室等试用,验证了RNA标准物质的普适性.这一RNA标准物质的研制为新型冠状病毒检测试剂盒的质量控制提供了计量学依据,为防控流行性疾病提供了便利.     

“垃圾”DNA的奥秘

依据DNA双螺旋和遗传信息的中心法则,只有编码蛋白的DNA才被认为是有功能的.然而人类基因组大小与蛋白质数量矛盾以及生物体进化与基因组大小的不相关性(即C值悖论),导致科学家对非编码DNA概念的提出,戏称这些DNA为"垃圾"DNA.随着第二代测序技术发展以及数据分析能力的提升,大量研究表明,这些"垃圾"DNA很多都可以在生理与疾病状态下特异性转录.同时,疾病全基因组相关联研究显示,大量与疾病相关单核苷酸多态性位点位于非编码区,这共同证明了它们是有功能的.进一步研究表明,人类基因组中至少75%的序列是转录的,并将这些转录且不编码蛋白质的产物称为非编码RNA.本研究组系统总结了3大类非编码RNA包括微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA的定义和分类以及在疾病中的功能,对这些的非编码RNA的研究将会为疾病的治疗以及诊断方法开启新纪元.     

水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)是中国及东南亚国家水稻上的一个重要病原, 但有关RGDV与植物细胞互作的分子机制仍不清楚. 本研究利用农杆菌共渗透的方法鉴定了RGDV基因组S11片段编码蛋白Pns11在转GFP (green fluorescent protein)基因本生烟纯合系(Nicotiana benthamiana line 16c)中的抑制子活性. 在该系统中, Pns11 能抑制由GFP正义RNA介导的局部和系统沉默, 并能灭活RNA沉默信号或阻断沉默信号的移动. 体外表达Pns11能增强马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)在本生烟上的致病性. 该抑制子在局部和系统沉默抑制实验中能降低siRNA 的累积, 但不能完全消除其存在. 结果表明, Pns11干扰了RNA沉默途径的起始阶段.     

RNA m5C修饰调控病毒复制的研究进展

5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m⁵C)作为一类重要的转录后修饰形式,在真核生物信使RNA(messenger RNA,mRNA)、转运RNA(transfer RNA, tRNA)和核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA)上普遍存在,并且参与调控RNA出核、翻译和稳定性维持等代谢加工过程.该修饰是动态可逆的,由甲基转移酶(methyltransferases)催化生成,并由去甲基化酶(demethylases)移除,通过招募特定的识别蛋白(reader proteins, readers)参与调控胚胎发育、肿瘤发展和干细胞分化等生理及病理过程.近期研究表明,除真核生物RNA外,病毒RNA上同样富含m⁵C修饰,并且在转录、剪切和翻译等复制阶段扮演重要角色.此外,病毒感染可诱发宿主RNA的m⁵C修饰改变,从而影响宿主对病毒感染的应答反应.随着RNA m⁵C修饰测序技术的快速发展,病毒m⁵C修饰的相关报道大量涌现,然而m⁵C修...     

RNA干扰介导对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区或表面抗原编码区的siRNA表达载体pSI-C和pSI-S, 在体外HBV复制细胞模型中观察对HBV复制和表达的影响. 将pSI-C, pSI-S与1.3倍HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞, 分别在转染后24, 48和72 h, 观察pSI-C和pSI-S对细胞上清和胞内病毒抗原表达的影响, 并用分子杂交方法从病毒复制、转录和翻译水平检测目的基因的表达情况. 实验结果表明, pSI-C及pSI-S能明显抑制细胞内HBsAg和HBcAg的合成, 呈序列特异性和剂量依赖性的特点, 而对照组siRNA无抑制作用. pSI-C比pSI-S抑制作用更强, 转染后第2天对HBsAg和HBeAg抑制率达高峰, 分别为92%和85%. Southern和Northern杂交结果表明, HBV siRNA能降低目的基因转录和病毒复制中间体的表达水平, 提示针对乙型肝炎病毒核心区和表面抗原编码区的siRNA能有效抑制HBV RNA分子转录和病毒复制, 最终降低病毒抗原表达, 这为运用RNAi技术进行HBV基因治疗提供了新的思路.     

角色小 威力大

病毒变异产生大杀伤力 美国军队病理研究所的病理学家杰弗里·陶本伯格(Jeffery Taubenberger)证明1918年的流感病毒与猪流感病毒十分相似,是一种与甲型流感病毒(H1N1)密切相关的病毒.陶本伯格所在的研究所保留有西班牙流感死亡者的肺组织,他与同事利用遗传学技术聚合酶链反应的方法(PCR)对其中一位21岁士兵的肺部组织进行基因扩增和转录,找到了一些西班牙流感病毒的RNA(核糖核酸)碎片.