产气荚膜梭菌α毒素研究进展

对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理、检测及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。     

微量法测定产气荚膜梭菌α毒素

为了快速、灵敏地测定样品中的产气荚膜梭菌α毒素，本实验以产气荚膜梭菌培养滤液经硫酸铵分段盐析、丙酮分段沉淀及凝胶过滤得精制α毒素，在96孔细胞板上，经卵黄反应浊度(微量)法测定精制α毒素及培养滤液卵黄反应滴度分别为1：32768和1：2048，且该方法特异性强、稳定性好，是产气荚膜梭菌α毒素的一种快速、简便的检测手段．     

C型产气荚膜梭菌PCR快速检测方法的建立

为了对产气荚膜梭菌进行快速检测,本研究以GenBank发表的产气荚膜梭菌α毒素、β毒素作为参考,应用生物学软件设计扩增C型产气荚膜梭菌α毒素和β毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp与927 bp;建立PCR反应体系并设置反应条件;反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果表明,设计的引物可以良好的扩增出C型产气荚膜梭菌的α毒素和β毒素基因,扩增的基因片段大小与预期的一致,阴性水对照与ε毒素对照扩增电泳泳道均为阴性。此方法用于判定C型产气荚膜梭菌的毒素型是可行的。     

产气荚膜梭菌ε毒素的细胞毒机制及致病机理的研究进展

产气荚膜梭菌ε毒素（Epsilon toxin ,ETX）由B、D型产气荚膜梭菌产生并分泌至宿主动物体内,在临床上主要症状为肠毒血症．ETX属于以七聚体形式存在的β‐样成孔毒素,它能够形成由14个β折叠片组成的“β‐桶状”结构,这个“β‐桶状”结构可以插入真核细胞的质膜形成穿孔．在细胞水平,ETX能够迅速使细胞膜肿胀、多种细胞器破坏,最终导致靶细胞的坏死．在哺乳动物体内,ETX能够使哺乳动物血管产生水肿,从而穿透血脑屏障而聚积在动物肾和脑中,导致机体随着谷氨酸盐的释放而产生过度兴奋,这一系列反应的发生可以引起机体出现脑水肿和肾衰竭,最终导致动物的死亡．目前, ETX备受关注的主要原因不仅仅因为它是一种β‐样成孔毒素,而是可以作为潜在的一种工具类药物,经改造后可以携带治疗药物在短时间内靶向性地到达哺乳动物脑和中枢神经系统,继而为脑和中枢神经系统疾病的治疗提供新的方向．结合国内外相关研究,对ETX细胞毒机制及致病机理进行了综和评述．     

B型产气荚膜梭菌β毒素的表达与纯化

将构建好的表达产气荚膜梭菌β毒素的重组质粒pET-32a-β转化大肠杆菌BL21(DE3),将得到的重组菌株BL21(DE3)(pET-32a-β)用IPTG进行诱导表达,探究其最佳诱导时间.对所表达的β毒素包涵体进行变性、纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性蛋白,动物免疫实验取得了良好的结果,为下一步抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体和单链抗体的研究奠定基础.     

产气荚膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术，从C型产气荚膜梭茵中国标准株C59-44基因组DNA中扩增出了约0．7kb的基因，并将其克隆到pGEM-T栽体上，经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明，该基因片段的核苷酸序列与国外报道的β2毒素基因序列一致．     

多重聚合酶链反应检测污水中产气荚膜梭菌

根据产气荚膜梭菌产生4种主要毒素（α、β、ε、τ-毒素）可分为A～E5种菌型。依据产气荚膜梭菌的5种毒素基因的序列，设计5对PCR引物，建立多重聚合酶链式反应（PCR）方法，以快速区分5种类型的产气荚膜梭菌，68份环境样品（生活污水、屠宰场污水）的常规检测和基因分型共检出55株产气荚膜梭菌，其中A型产气荚膜梭菌51株，占总数的90%以上，B，C，D3种类型只占5%。试验未检出E型产气荚膜梭菌，所有的分离株未发现带有肠毒素，结果表明：目前污水中主要存在的菌型为A型菌，其他菌型的产气荚膜梭菌很少，而多数是非致病性产气荚膜梭菌。     

抗CPAα毒素单链抗体基因的克隆和表达及其生物学特性研究

应用RT—PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌 (CPA)α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其定向克隆于表达载体 pHOG2 1中 ,构建重组表达载体 pHOG 2E3,转化至大肠杆菌XL1 Blue中 ,筛选出表达菌株XL1 Blue(pHOG 2E3)。SDS PAGE分析结果表明 ,在 2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %,ScFv蛋白主要以包涵体的形式存在 ,但在胞周质和培养上清中也能检测到ScFv蛋白 ,其中在胞周质中表达的ScFv蛋白占菌体可溶性蛋白的 4 %。生物学试验结果表明 ,ScFv基因表达产物不仅能够中和α毒素的磷酯酶C活性 ,而且对攻击致死剂量α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

两种抗α毒素单链抗体基因的序列分析

应用RT－PCR技术,从两株分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜酸菌α毒素单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株2E3和1A8中,分别扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser）3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因2E3－ScFv和1A8－ScFv,并将其克隆至pGEM-T载体中,经核苷酸序列分析证实,VH和VL基因以及Linker基因拼接正确,2E3－ScFv基因全长为729bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可燮区基因特征,2E3－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链kⅢ家簇;而1A8－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链кⅥ家簇。     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将2种抗A型产气英膜梭菌α毒素单链抗体（ScFv）基因ScFv－2E3和ScFV-1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET-20b,pET-28a和pHOG21中,构建了重组质粒PUC2E3和pUC-1A8,pET20b-2E3和pET20b-1A9,pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-1A8,然后分别转化至大肠杆菌中,提取质粒,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段,说明已成功构建了8个含ScFv基因的表达质粒。     

兔魏氏梭菌的分离及鉴定

运用诊断实验技术,对某兔场一例进口种兔的疑似兔魏氏梭菌,所引起的急性胃肠炎进行了诊断,以期对该病的诊治和预防提供参考。通过选择性分离纯化培养、生化反应、16S rDNA扩增测序及序列比对分离出一株兔魏氏梭菌。动物实验表明,该菌株具有强致病性。药敏试验结果筛选出的药物为该病治疗和预防提供了参考依据。     

应用梭状芽孢杆菌口服疫苗载体表达HIV p24蛋白的研究

应用一种不产毒的梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens,C.P.）作为口服疫苗载体表达HIVp24蛋白。用PCR扩增HIVp24基因,酶切后插入到含有C.P.序列的pJRC200质粒的CPEORF中,将重组的cp24质粒转化无致病作用的ATCC3624菌株。使HIVp24基因在C.P.形成芽孢时大量表达。结果应用SDS_PAGE和West Blot分析HIVp24在重组C.P.繁殖体和芽孢中的表达情况,发现HIVp24蛋白在C.P.芽孢体中大量表达,而在C.P.繁殖体中却没有表达。证明在体外构建了含有HIVp24基因的重组pJRC200质粒,成功地表达了HIVp24蛋白并得到了HIVp24的高表达ATCC3624菌株。为成功研究C.P.作为一种口服HIV疫苗载体奠定了基础。     

A型肉毒杆菌毒素的基因测序与分析

对国内A型肉毒杆菌毒素基因测序,分析了解毒素基因结构并推测其氨基酸序列。提取肉毒杆菌总DNA,利用自行设计的引物对目的基因进行PCR扩增,把目的基因导入E.Coli JM109,筛选含目的基因的阳性克隆菌进行测序和分析,从而了解毒素基因结构并推测其氮基酸序列。对A型肉毒杆菌毒素基因的核苷酸序列成功测序并与GenBank中的相应序列比较,其序列同源性为96％。推测其氨基酸序列同源性为100％。成功地对A型肉毒杆菌毒素的基因进行了测序,这为肉毒杆菌毒素中毒的快速诊断,以及进一步探求以基因工程方法生产此毒素奠定基础。     

野生动物细菌性疫病的研究进展

介绍了野生动物细菌性疫病的现状,通过对结核病、布氏杆菌病、魏氏梭菌病的阐述,提出了野生动物细菌性疫病防控策略,依法建立长期有效的防控机制,确保人与自然的和谐持续发展。     

作物耐盐性的分子生物学研究进展

本文从作物耐离子胁迫、耐渗透胁迫和细胞编程性死亡调节三个方面概述了作物耐盐的生理生化机制;介绍了目前利用分子生物学技术克隆与植物耐盐相关的基因,并根据作物的耐盐机理,对这些与耐盐相关的基因进行了分类;总结分析了转耐盐基因植物的研究现状及其转基因植物的耐盐生状况,并提出了利用转基因技术,改良植物耐盐性的方法和对策。     

大肠杆菌耐热性肠毒素（ST）的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素（ST）在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁。文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义。