松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

松材线虫携带细菌部位的电镜观察

对活体松材线虫样品进行处理,用透射电镜对松材线虫各部分进行切片和详细观察,未能在线虫体内的任何部位观察到细菌。然而,用较少脱水步骤的扫描电镜样品处理方法处理活体松材线虫,用扫描电镜在线虫体表观察到了许多细菌这些细菌形态一致、杆状、长１．４８～１．７３ｕｍ、直径０．４９～０．６２ｕｍ。本是关于松材线虫携带细菌部位的首次报道。     

松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

为了筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的拮抗细菌,从马尾松林中分离获得了230株细菌,并从中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌,其中JK-JS3菌株对松材线虫的杀线活性最高.将该细菌培养滤液分别稀释2倍、4倍、10倍处理松材线虫,72h后线虫的死亡率均达到100%;线虫死亡后虫体消解,消解率分别为100%、97.8%、96.4%.测定了该细菌培养滤液对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)等植物线虫的杀线活性,结果表明对不同种的线虫杀线活性有差异.该菌株培养滤液对松材线虫和小杆线虫(Rhabditis sp.)的杀线活性最高,其余杀线活性从高到低依次为拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、腐生线虫(Panagrellus redivivus)、香蕉穿孔线虫和水稻干尖线虫.形态特征和革兰氏染色观察,该细菌为革兰氏阳性菌、产芽孢、具有周生鞭毛;经Biolog细菌鉴定仪进一步鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).     

松材线虫携带的细菌的寄生性和致病性研究

用荧光方法观察了松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）携带的细菌对悬浮培养的黑松（Pinus thunbergii）细胞的毒性,表明其中的假单胞菌、荧光假单胞菌和少动鞘氨醇单胞菌的滤液对黑松细胞具有较强的毒性,这与松树发病早期出现的细菌种类一致;这些细菌在添加松树提取液的细菌培养基上不能生长或基本不能生长,表明松树体内可能存在某些不利于细菌生长的物质;同时,单独接种这些细菌不能感染健康的黑松,因此,在线虫最初进入树体中,细菌的生长与线虫密切相关．     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

松材线虫体表物质与其携带细菌的关系

松萎蔫病是由松材线虫与其所携带的细菌复合侵染所引起。为进一步明确松材线虫与其携带细菌的关系,笔者用无菌线虫体表浸泡物处理细菌,再将无菌线虫各虫株与细菌共培养,结果表明细菌的存在可促进线虫的繁殖,线虫体表浸泡物质可促进细菌繁殖,无菌线虫与细菌共培养后线虫繁殖数量较无菌线虫单独培养有明显增加,说明松材线虫与其体表细菌的关系为一种互惠关系。此外还设计了无菌线虫对细菌的趋向性试验,考察线虫与自身体表所携带细菌之间的趋向性是否具有特异性,结果表明所有无菌线虫对成团泛菌具有明显的趋向性,各无菌松材线虫对于分离自各自体表的细菌菌株没有特异的趋向性。     

抗生素对松材线虫携带菌的制菌效应研究

对从长岛松材线虫体表分离的3株携带菌株即中间肠杆菌(Esherichia intermedium)、鲁氏不动杆菌(Acinnetobacter lwoffi)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),选用分属于6大类的8种抗生素进行了抗生素药敏定性试验,初选出5种有效抗生素,采用对倍稀释法进行进一步定量试验,确定了抗生素的最小抑菌浓度(MIC).结果表明,阿奇霉素、阿米卡星和诺氟沙星对单一菌种及混菌作用明显,有效浓度范围宽,这可为获得无菌松材线虫提供参考依据.     

松材线虫携带细菌数量的测定及无菌松材线虫的培养

对来源于自然条件和常规培养条件下的松材线虫携带的细菌数量进行了测定 ,并采用黑松愈伤组织对松材线虫进行了纯培养。结果表明 ,自然感病的黑松病组织中的松材线虫携带活细菌的数量平均为 2 .9× 10 2 个 条 ,灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为 3.0× 10 3 个 条 ;来源于自然感病的黑松和马尾松上的松材线虫 ,经无菌处理后 ,在黑松愈伤组织上生长良好 ,用 3g新鲜愈伤组织培养 9d ,虫口数量可达 10万余条。     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫行为学研究进展

对松材线虫的侵入、松材线虫在树体内的运动与迁移、取食和繁殖等方面的行为学研究进展进行综述。松材线虫侵入寄主体内主要是随着松天牛取食进行的；而类脂含量降低后，松材线虫具有脱离松天牛而进入寄主的特性；挥发性物质尤其是β-香叶烯在松材线虫进入树体内起重要作用。温度、湿度、不饱和脂肪酸、树脂道、寄主生理状况等均影响到松材线虫的运动与迁移。松材线虫侵入树体后，大多滞留在树脂道，蜕皮变为成虫后再向其它部位迁移。蛹室中天牛释放的化学物质可吸引松材线早向蛹室迁移。松材线早在树体内主要以薄壁细胞为食，病树枯死后则以真菌等为食。温度和水分是影响松材线早繁殖行为的主要外界因子。松材线早的性引诱方式为相互引诱，但性信息素的化学特性尚等继续研究。     

不同马尾松种源对松材线虫病的抗病性

在１９９５～１９９８年连续４ａ的人工接种试验中,从全国４０个马尾松种源中选出的广西２号、广西３号和广东５号３个抗松材线虫病种源的抗性稳定,无任何感病症状,其它种源均有不同程度的感病症状,抗病种源的抗性表现与下列因子有关：（１）３个抗病种源生长势均是较旺盛的;（２）抗病马尾松种源ＣＡＴ的活性强于敏感和轻感和轻感种源;（３）抗病种源广西２号的１０种游离氨基酸含量较其它感病和敏感种源的含量低;（４）抗病     

松材线虫病疫木的微波除害处理技术

采用微波技术对松材线虫病疫木板材进行除害处理并获得成功。通过对相关技术指标的测试,计算出松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner＆Buhrer）Niekle）和松褐天牛（Monochamus altermatus Hope）致死临界温度及不同厚度、湿度板材的有效处理时间。该项处理技术能够100％杀死松材线虫病疫木板材内松褐天牛和松材线虫,符合国家对松材线虫病疫木安全利用的要求。经安全性和稳定性测试,微波泄漏量低干国家标准,微波输出功率稳定,输送系统运转正常。该项处理技术高效快捷、安全可靠,对环境友好、先进适用,可用于一定厚度板材的检疫除害处理。     

松材线虫病死木中真菌和细菌的分离

从来自江苏省和浙江省几个疫区的松材线虫(PWN)病病死木的木质部中分离出111个真菌菌株，经鉴定种类为木霉(Trichoderma spp．)、轮枝霉(Verticillium spp．)、青霉(Penicillium spp．)、镰孢霉(Fusarium spp．)、曲霉(Aspergillus spp.)、毛壳菌(Chaetomium spp．)、茎点菌(Phoma spp．)、短梗单孢霉(Dicoccum sp．)、头孢霉(Cephalosporium sp．)、交链孢霉(Alternaria sp．)，这些真菌约占分离真菌总数的60％；在43％的未鉴定菌中，除3个菌株为有孢菌外，其余均是无孢菌。可以分离出真菌的病死木占56．42％，从病死木中可分离出细菌的比例达86％，可同时分离到真菌和细菌的比例为43．6％。     

苦豆草生物碱对松材线虫的抑制作用

分别用槐果碱、苦参碱、槐胺碱、苦豆碱、野靛碱、N-甲基野靛碱、莱曼碱和总碱配制成生物碱浓度为1×10-4g/mL的PDA培养基,并在培养基上接种灰葡萄孢菌后再接种松材线虫,观察、记录松材线虫繁殖的情况。结果表明,苦豆碱、野靛碱和总碱对线虫的抑制繁殖作用都较强,其中,苦豆碱能完全抑制线虫的繁殖,且能引起线虫的死亡。对测定的生物碱的分子结构及对松材线虫的活性的分析进一步验证了关于双稠哌啶类生物碱对松材线虫的活性与其分子结构中的官能团对之间关系的假说。     

松材线虫对黑松、湿地松幼苗活性氧代谢的影响

以2月龄黑松（Pinus thunbergii)、湿地松（P.elliottii)幼苗为材料，研究松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus)感染对松幼苗活性氧代谢的影响。在接种松材线虫后，黑松较湿地松发病快且重，黑松内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性逐渐降低；湿地松内SOD和CAT在接种早期活性增加，随后下降。两种幼苗接种后，过氧化物酶（POD）活性、H2O2和丙二醛（MDA）含量不断增加。H2O2和MDA的积累与植株发病速度呈明显正相关。因此，松材线虫病的发生和发展与寄主植物组织的膜脂过氧化作用有关。     

松材线虫在抗性黑松体内移动及寄主水势变化

以接种松材线虫的1年生抗性黑松苗为实验材料,用感病黑松苗作对照来研究松材线虫在抗性黑松体内的移动及寄主水势变化.结果表明:接种初期,松材线虫在树体内的数量少,移动速度慢;在抗病黑松体内,线虫主要向下移动,且虫体数量明显少于在感病黑松体内的数量;在感病黑松体内线虫自接种点向上、下移动,且向下移动的速度和虫体数量明显大于向上的.随着时间的推移,线虫开始繁殖,扩散能力增强.水势测定结果显示,感、抗病黑松水势变化总趋势是先上升后下降再上升.     

松材线虫病研究进展

松材线虫病引发严重经济损失和重大生态灾难,受到各国重视,成为检疫对象,我国疫区已扩大到14省市,致死松树5亿多株,毁林30多万hm2,损失上千亿元.各国在该病的基础研究方面有一些进展,但防控方面仍困难重重.我们从病原和防治这两方面开展研究,在检测手段和防治方法上进行创新,研制了松材线虫早期诊断检测管(简称检测管)、快速分离器I型和II型、疫木处理器及松墨天牛高效引诱剂、基于检测管的松材线虫病早期诊断体系、基于快速分离器的松材线虫快速检测体系、检测松墨天牛携带线虫情况的新技术、用雾化分离器高通量检测松墨天牛带虫情况等新技术,其中6项技术成果已经在生产实际中应用并开始推广.同时鉴定并描述了十几种寄生松树的线虫.