利迪链霉菌A02细菌人工染色体基因组文库的构建

 利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物真菌病害高效生防菌,其活性产物为安全高效广谱的抗真菌剂纳他霉素。为了克隆纳他霉素生物合成基因簇和调控其表达相关的功能基因,通过基因改良的方式进行A02的定向分子改造,提高纳他霉素的效价和产量,提取了利迪链霉菌A02的基因组DNA,用Hind III和Bam HI部分酶解后,回收了97~194kb和48.5~97kb大小的高分子量DNA,与质粒载体Copycontrol pCC1BAC连接,分别构建了含有800个和1500个克隆的两个BAC文库。从文库中随机挑选20个克隆,酶切检测平均插入片段分别为133kb和65kb,空载率小于1%,假定利迪链霉菌的基因组有8×10⁶kb,计算文库基因组覆盖率分别为12.28倍和11.25倍。因此,从文库筛选到目的片段的概率达99.99%以上。     

褐黄孢链霉菌生产纳他霉素工艺条件研究

目前,国内纳他霉素产量低,为提高其产量,实现其工业化生产,主要对褐黄孢链霉菌ATCC 13326发酵生产纳他霉素的培养条件及前体添加策略进行研究.得出最佳培养条件为:培养温度28℃,种龄40～44 h,接种量10%,装液量10%,初始pH 7.3,发酵24 h时加入O.6%的前体丙酸钠.在此条件下摇瓶分批发酵生产纳他霉素的产量可达到6.87g/L,比未添加前体的纳他霉素产量(3.72 g/L)提高了84.7%.利用10 L发酵罐进行纳他霉素的发酵研究,在最优培养条件下,发酵罐中的纳他霉素产量可达到8.34 g/L,比摇瓶分批发酵生产纳他霉素产量(6.87 g/L)提高了21.4%.     

抗生素生物合成调控元件的功能解析

抗生素生物合成的整个过程由多个环节构成,受到前体物供给、装配、外运、调控和抗性等因素的影响,因此形成了相应的各种生物合成元件和模块。其中最为重要的是控制生物合成基因转录和翻译等表达水平的调控蛋白及其机制。放线菌的调控蛋白有全局性、多效性和途径专一性三种类型,并形成复杂的级联调控网络,对抗生素的合成实施严谨的控制。调控基因的功能鉴定和调控机理的解析是定向提高生物合成基因转录水平和抗生素产量的重要前提,也是构建抗生素高效合成的放线菌底盘生物的必要基础。在该研究执行的前两年,本研究重点对纳他霉素产生菌和天蓝色链霉菌的多个重要调节基因及其调控机制展开了深入的研究。抗生素生物合成途径优化的重要策略之一是提高生物合成基因及其编码蛋白的表达水平,因此,解析抗生素生物合成的调控机制是实施该策略的重要前提。该研究对恰塔努加链霉菌和天蓝色链霉菌中跟那他霉素、十一烷基灵菌红素和放线紫红素相关的多个途径专一性基因和多效性基因进行了功能鉴定,揭示了放线菌抗生素生物合成复杂而特别的调控机制,为途径优化和优良底盘生物的构建奠定了基础,而且通过调控基因的改造显著提高了抗生素的产量或缩短了发酵周期,已经初步显示出改造调节基因是提高抗生素产量的重要合成生物学策略。     

利迪链霉菌A02产纳他霉素补料分批发酵参数的优化

 为建立利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02 生产纳他霉素的高产发酵工艺,对其补料分批发酵的主要参数进行了优化。利用pH 值实时监控自动补料摇床辅助优化,筛选出利迪链霉菌A02 产纳他霉素的适宜pH 值范围,以此为控制点进行30 L自动发酵罐补料分批发酵实验,通过分析软件发酵之星（Biostar）5.0 检测分析主要发酵参数动态趋势曲线与纳他霉素产量的相关性。结果显示,菌株A02 最适于纳他霉素生物合成的发酵过程多参数优化组合为：培养温度30℃,pH 值控制在6.25~6.29 范围内,溶氧（DO）为20%~30%,摄氧率（OUR）和CO₂释放率（CER）分别为25~15 mmol/（L·h）和20~12 mmol/（L·h）,氨基氮含量0.20~0.23 g/L,还原糖保持1.5%左右,至88 h 后自然下降,至112 h 为0.32%;此时纳他霉素质量浓度达最高值,发酵上清液中为2.02 g/L,发酵液中为6.98 g/L,较不控制pH 值的对照分别提高28.66%和69.83%,为较好的发酵终点。通过优化调控主要发酵参数有效提高了利迪链霉菌A02 生产纳他霉素的发酵水平。     

几种保鲜药在柑桔贮藏中的防病效果

选取4类有代表性的防腐保鲜剂对柑桔的两大品种进行了贮藏试验,在常温等相同环境条件下,观察记录各自的褐疤果、腐烂果及发病果并统计相关指标.结果表明:防病效果相对较好的仍是各药(纳他霉素、多菌灵、抑霉唑)与2,4-D联用的处理.对98天贮期的温州蜜柑而言,5号处理(多菌灵加2,4-D)的总病率最低(5.4%),其腐烂率为5.07%;对136天贮期的447而言,9号处理(纳他霉素加2,4-D)效果最好,腐烂率仅为4.76%.生物防腐剂纳他霉素的防腐效果前期很好,它与2,4-D合用的增效作用体现在贮藏后期;植物源中药3与微生物制剂纳他霉素单用的防病效果接近,而且都存在药力持久性问题.     

几种保鲜剂处理对银杏果贮藏中质构特性的影响

以银杏果主栽品种‘大佛指’为试材,分别采用不同浓度的1-甲基环丙烯(1-MCP)熏蒸、纳他霉素喷涂以及壳聚糖浸泡处理银杏果,研究其在0℃冷藏后贮藏品质的质构变化。结果表明:壳聚糖浸泡处理可缓解银杏果贮藏中水分的散失,经纳他霉素处理可降低银杏种仁霉变率,使用1-MCP处理可保持淀粉含量在较高水平;应用质构仪质地多面分析法(TPA)及穿刺下压破碎试验对贮藏后银杏果进行质构测试,得出500 mg/L纳他霉素可有效保持银杏果贮藏后的质地,3种保鲜剂分别在1.0%壳聚糖、0.5μL/L 1-MCP、500 mg/L纳他霉素处理时,可有效保持银杏果贮藏品质,延长贮藏时间。     

aurT基因对金褐霉素生物合成的调控及其作用机制

通过分子克隆技术获得了金褐霉素生物合成基因簇中新基因aurT(Genbank登录号:MH247109.1),并利用高效表达、基因敲除、高效液相色谱(HPLC)和生物信息学技术分析了aurT基因功能及其对金褐霉素生物合成的调控作用,以期为提高金褐霉素发酵产量奠定理论基础。研究结果表明:AurT属于RhtB家族调节因子,是金褐霉素生物合成的氨基酸转运蛋白;aurT基因高效表达菌株(♂aurT)的金褐霉素产量增加了1.3倍;aurT基因敲除菌株(ΔaurT)的金褐霉素产量减少了65%,但金褐霉素的产量没有完全被抑制,说明aurT对金褐霉素生物合成的调控过程不同于途径特异性调控基因aurJ3M。比较了4种不同的PI因子结构类似物(1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺)对金褐霉素合成的调控作用,结果表明:0.4 mL的丙三醇对金褐霉素生物合成的调节效果最佳;发酵时间达到96 h时,外源添加丙三醇后,ΔaurT菌株的金褐霉素产量为784μg/mL,而未添加的产量为244μg/mL;进一步通过RT-PCR反应验证在野生型菌株培养中添加丙三醇后,增加了aurT基因的转录水平和表达,说明PI因子结构类似物与基因簇中的特异性受体结合并启动了相关基因的表达,aurT是通过介导PI因子的胞外运输来参与金褐霉素的生物合成与调控的。     

纳他霉素高产菌株选育及发酵工艺优化

以纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)4.3505为出发菌株,以紫外线作为诱变方法,筛选抗乙酸钠高产纳他霉素的突变菌株,优化发酵条件,筛选诱导子及添加工艺。研究结果表明:高产突变菌株为纳塔尔链霉菌HW-2,其纳他霉素产量在发酵120 h后达到452.2 mg/L,比原始菌株提高了242.6%,该菌株遗传性能稳定。纳塔尔链霉菌HW-2生产纳他霉素最佳发酵条件:接种量为发酵液总体积的6%,250 mL三角瓶装液量为30 mL,初始pH值为7.5。乙酸钠为最佳前体物质,乙酸钠的质量分数为0.2%,添加时间为发酵后24 h。     

海洋灰绿曲霉聚酮合酶基因的克隆与序列分析

为了研究海洋灰绿曲霉中抗肿瘤聚酮化合物灰绿霉素A的生物合成机制,需获得相关的聚酮合酶基因簇。根据灰绿霉素A合成途径推断,该化合物母核由非还原型PKS(NR-PKS)催化合成,本文使用LC系列简并引物得到灰绿曲霉中NR-PKS基因片段,再通过基因走读技术得到22.8kb的DNA序列,其含有7个完整的开放阅读框。通过BLAST分析,序列中包含1个NRPKS编码基因,全长8 451bp,命名为Agpks1。AgPks1与烟曲霉PksP、黑曲霉Alb1有很高的同源性。该工作对研究Agpks1对灰绿霉素A或其他聚酮产物合成的催化机制具有重要意义。     

厚皮甜瓜贮期腐烂病病原菌分离鉴定及抑菌实验研究

对厚皮甜瓜采后贮藏期间腐烂病的病原菌进行了分离、纯化与鉴定,研究了ε-聚赖氨酸、壳寡糖、纳他霉素和右旋龙脑对厚皮甜瓜病原菌生长繁殖的影响。结果表明,厚皮甜瓜贮期腐烂病病原菌为链格孢菌(Alternaria alternata)和爪甲曲霉(Aspergillus unguis)。ε-聚赖氨酸和纳他霉素抑菌效果显著,当ε-聚赖氨酸浓度为20.0mg/L、纳他霉素浓度为4.0mg/L时,即可完全抑制两种病原菌的生长繁殖。壳寡糖和右旋龙脑对链格孢菌和爪甲曲霉均有一定的抑制作用。     

新功能人造生物器件的构建及集成/人工细胞的代谢网络改造与系统优化

该研究采用合成生物学的理念和方法,结合代谢工程的手段,理性设计、构建、优化了埃博霉素在天蓝色链霉菌和紫杉醇、达玛烯二醇在酵母中的异源合成模块。在该研究中,建立了高通量萜类合成途径分析平台。通过基因替换、蛋白表达水平微调控对大肠杆菌MEP途径进行改造,从而构建适合IPP和DMAPP生产的底盘细胞。今年主要的工作为构建大片段DNA合成与组装技术平台,完成了体外全合成全长的简适线粒体DNA分子并完成了测序鉴定。分析了细胞代谢与线粒体形态的变化规律,为日后开展简适线粒体DNA导入后细胞代谢变化分析提供了技术基础。     

MarR家族蛋白Orf17在自溶链霉菌格尔德霉素生物合成中的调控作用

格尔德霉素是自溶链霉菌产生的具有极强抗肿瘤活性的活性物质,但格尔德霉素生物合成的具体调控机制还不清楚.为了深入解析自溶链霉菌中格尔德霉素生物合成的调控机制,对其合成途径中一个MarR家族调控蛋白Orf17的功能及其调控作用进行了研究. HPLC分析显示,敲除了orf17基因的突变株中格尔德霉素的产量相比野生型降低,表明Orf17对格尔德霉素的生物合成起到了正调控作用;RT-PCR检测表明,在orf17突变株中与格尔德霉素合成相关的基因almAI、almF、almM、almH、almRⅠ、almRⅡ和almRⅢ的表达下降,表明这些基因的表达直接或间接地受到了Orf17的调控.进一步从orf17突变株中分离纯化出3个相比野生型产量升高的化合物,经鉴定为洋橄榄叶素及其衍生物.综上所述,Orf17在格尔德霉素生物合成中起到正调控作用,而对洋橄榄叶素的生物合成可能起到负调控作用.     

基于UFLC-Q-TOF-MS/MS技术的盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片杂质的研究

采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技术,在正离子模式下,根据各物质的质谱裂解规律,研究鉴定出盐酸克林霉素棕榈酸酯分散片中16种杂质,其中克林霉素九酸酯、克林霉素十酸酯、克林霉素十一酸酯、克林霉素十三酸酯为首次检到,本研究为其质量监控提供了实验依据。     

Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119提取液中米多霉素及其衍生物的分析

通过对Streptoverticillium rimofaciens ZJU5119的菌种培养和发酵,利用高效液相色谱-质谱(HPCL-MS/MS)连用技术分析了其发酵液中米多霉素提取物的组成和结构.结果表明:在提取物中,除米多霉素外还含有3种衍生物,其中2种为首次报道;该方法为寻找发酵物中高效抗生素衍生物的提取和分析提供了依据;同时,也为寻找通过组合生物化学合成的新衍生物提供了分析手段.     

金褐霉素和纳他霉素对冬枣品质及代谢相关酶的影响

通过研究金褐霉素对果蔬采后品质的贮藏保鲜效果,开发金褐霉素作为抗真菌的食品防腐剂。将冬枣分别用金褐霉素和纳他霉素(1.0g/L)浸泡后,在4℃下贮藏并检测冬枣的品质及代谢相关酶。结果表明,同纳他霉素相比较,金褐霉素能更好地保持冬枣果实硬度,减少转红率和失重,抑制丙二醛含量的上升及多聚半乳糖醛酸酶活性的提高,抑制果实中可溶性固形物及Vc含量的下降,提高了冬枣的苯丙氨酸解氨酶的活性。研究表明,金褐霉素在不损害果实质量的前提下,能够有效地控制冬枣采后腐烂,具有较好的保鲜效果。     

阿奇霉素相关物的制备

为解决国内缺少阿奇霉素杂质对照品的现状,加强阿奇霉素的质量控制,通过化学合成或半制备液相色谱分离的方法制备了红霉素A 6,9-亚胺醚,红霉素A 9,11-亚胺醚,3-去克拉定糖阿奇霉素,3’-N-去甲基阿奇霉素,3’-N-去甲基-3’-N-对-乙酰胺基苯磺酰基阿奇霉素和阿奇霉素B 6种杂质的纯品. 经过核磁共振、质谱等手段确认各化合物结构正确;并从生产工艺出发详细分析了各杂质的来源和可行的控制方法.      

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

天然复合防腐剂在方便面料包中抑菌效果的应用

研究了天然复合防腐剂添加在方便面酱包中的抑菌效果.通过单因素实验,从乳酸链球菌素(nisin)、纳他霉素和壳聚糖3种天然防腐剂中确定两种对咖喱味酱腐败抑制作用较强的防腐剂,进行复配实验.复配出最优组合复合防腐剂为ω(nisin)添加量为0.02%、纳他霉素为0.006 5%.验证实验结果表明,该天然复合防腐剂组合抑菌效果与化学防腐剂抑菌效果相当.     

“微生物发酵溶菌酶替代饲用抗生素”,可为食品安全、畜牧业生产带来颠覆性变革

<正>溶菌酶具有广谱杀菌、抗病毒和消炎作用,尤其对抗生素耐药菌有较强杀伤作用,具有无耐药性、无残留、安全、绿色、环保的特点。常用于饲料、各种加工食品和饮料中,市场前景巨大,全球需求量达1万吨以上。但国内蛋清溶菌酶主要靠从鸡蛋清中分离提取,成本较大,产业化受原料制约;微生物发酵溶菌酶,由于其生产菌发酵单位低,限制了其大规模生产。浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室团队利用定点突变和基因重组改造等分子生物学技术,     

毕赤酵母新型反向筛选标记基因的鉴定

利用转座子突变技术构建毕赤酵母菌株突变库,并分离出能够在含雷帕霉素（10 ng/mL）培养基中生长的突变株mut375.通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）获取转座子侧翼序列,对转座子的插入位点进行定位.转座子插入PAS_Chr2-2₀375基因,破坏了其开放阅读框的完整性,将该基因命名为kFPR1.本研究利用同源重组敲除kFPR1基因使毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,回补该基因功能的菌株则不能在含雷帕霉素的培养基上生长.基于kFPR1基因的特性,建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法.以kFPR1作为反向筛选标记成功构建了表达EGFP的重组菌株并且回收了ZeoR筛选标记,为毕赤酵母的遗传操作提供了新的筛选工具.