犏牛及其亲本JGF2基因mRNA表达水平、DNA甲基化状态差异分析

黄牛与牦牛远缘杂交一代犏牛表现出很强的杂种优势,但其雄性不育使得杂种优势的利用受到了极大限制.为了从表观遗传学角度研究这一生殖隔离现象的生理机制,通过Real-time PCR检测了犏牛及其亲本睾丸组织中IGF2基因mRNA表达水平,并用亚硫酸氢钠测序法检测了血液和睾丸组织中JGF2基因第10外显子DMR区DNA甲基化状态.结果发现犏牛睾丸组织中IGF2基因mRNA表达水平最低,与亲本的表达水平差异极显著(P<0.01);牛(犏牛、黄牛和牦牛)血液和睾丸中JGF2基因的DNA甲基化程度均较高(90%以上),其中犏牛高于其亲本,但没有达到显著水平.实验结果说明IGF2基因mRNA表达水平与牛精子发生有关,可能在牛的精子发生过程中发挥重要作用,并可能与犏牛雄性不育有关;IGF2基因第10外显子DMR区的甲基化与IGF2基因在犏牛及其双亲睾丸中的表达差异无关,可能是其他的机制参与调节IGF2基因的表达.     

牛精子发生相关新基因b-DAZL的克隆、生物信息学分析与组织表达研究

人和多种动物的DAZL(Deleted in AZoospermia-like)基因是精子发生的重要调控因子,DAZL基因突变或表达缺乏将导致精子发生过程减数分裂障碍和雄性不育.文中采用电子克隆和克隆测序方法获得了黄牛DAZL基因cDNA全序列,利用生物信息学方法进行黄牛DAZL基因序列和蛋白结构分析,并对黄牛、牦牛和犏牛DAZL基因的组织表达特征进行了分析.结果发现：黄牛DAZL基因cDNA全长2509bp,编码295个氨基酸(命名为b-DAZL);b-DAZL基因含有12个外显子和11个内含子,定位于牛1号染色体末端;b-DAZL基因与哺乳纲各物种同功能基因开放阅读框的同源性为90%—94%,其编码蛋白含有DAZL典型的RNA识别基序（RRM）,DAZ 重复基序,Pumilio-2 和PABP 作用位点.RT-PCR结果显示：b-DAZL基因仅在成年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达,在成年F1代犏牛的卵巢组织中表达而在睾丸组织中检测不到表达信号,且犏牛睾丸组织切片表现出DAZL基因缺失的典型精子发生障碍表型,因此推测b-DAZL基因在牛精子发生过程中发挥重要作用,可能与F1代犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因.     

牛精子发生相关新基因b-DAZL的克隆、生物信息学分析与组织表达研究

人和多种动物的DAZL(Deleted in AZoosPermia-like)基因是精子发生的重要调控因子,DAZL基因突变或表达缺乏将导致精子发生过程减数分裂障碍和雄性不育.文中采用电子克隆和克隆测序方法获得了黄牛DAZL,基因cDNA全序列,利用生物信息学方法进行黄牛DAZL基因序列和蛋白结构分析,并对黄牛、牦牛和犏牛DAZL基因的组织表达特征进行了分析.结果发现黄牛DAZL,基因cDNA全长2509 bp,编码295个氨基酸(命名为b-DAZL);b-DAZL基因含有12个外显子和11个内含子,定位于牛1号染色体末端;b-DAZL基因与哺乳纲各物种同功能基因开放阅读框的同源性为90%一94%,其编码蛋白含有DAZL典型的RNA识别基序(RRM),DAZ重复基序,Pumilio一2和PABP作用位点.RT-PCR结果显示b-DAZL,基因仅在成年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达,在成年F1代犏牛的卵巢组织中表达而在睾丸组织中检测不到表达信号,且犏牛睾丸组织切片表现出DAZL,基因缺失的典型精子发生障碍表型,因此推测b-DAZL基因在牛精子发生过程中发挥重要作用,可能与F1代犏牛雄性不育相关,是犏牛雄性不育的候选基因.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

牦牛和不育犏牛睾丸中LGR4和ZNF281基因mRNA水平的分析

LGR4和ZNF281是信号转导通路中的重要分子,参与广泛的生物学过程.研究的目的是比较这两个基因在牦牛及其杂交后代睾丸中的表达.从成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸中提取总RNA,采用实时定量PCR技术检测LGR4和ZNF281基因的mRNA水平.结果显示,这两个基因在睾丸组织中均有较高的表达水平,其中LGR4基因在牦牛和犏牛睾丸中表达量没有显著差异,而ZNF281基因在牦牛睾丸中的表达量极显著高于雄性不育犏牛(P 0. 01),差异达4. 7倍.推测ZNF281在犏牛睾丸中的低表达可能与其雄性不育有关.     

利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中 的差异表达蛋白质

比较了牦牛和犏牛睾丸组织中蛋白质的表达差异; 应用双向电泳-质谱技术, 对牦牛和犏牛的睾丸组织中差异蛋白质进行分离和鉴定; 对获得的22个差异表达点进行质谱鉴定和数据库搜索, 获得了19个蛋白质, 其中有3种分子伴侣可能与犏牛雄性不育有关; 研究结果表明, 牦牛和犏牛睾丸组织中存在差异表达蛋白, 并可利用双向凝胶电泳进行分离, 为进一步分析犏牛雄性不育的原因提供了线索.     

利用双向电泳-质谱技术鉴定牦牛和犏牛睾丸中的差异表达蛋白质

比较了牦牛和犏牛睾丸组织中蛋白质的表达差异;应用双向电泳-质谱技术,对牦牛和犏牛的睾丸组织中差异蛋白质进行分离和鉴定;对获得的22个差异表达点进行质谱鉴定和数据库搜索,获得了19个蛋白质,其中有3种分子伴侣可能与犏牛雄性不育有关;研究结果表明,牦牛和犏牛睾丸组织中存在差异表达蛋白,并可利用双向凝胶电泳进行分离,为进一步分析犏牛雄性不育的原因提供了线索.     

黄犏牛与黄牛b-Boule基因编码区序列、结构、表达模式和睾丸组织表达水平的差异分析

Boule是动物精母细胞减数分裂过程中的必需蛋白,与精子发生减数分裂阻滞、雄性不育等密切相关.文中通过PCR扩增和克隆测序获得黄犏牛b-Boule基因的cDNA全序列,生物信息学分析发现黄犏牛b-Boule基因编码区全长885 bp,具有典型的RNA识别基序(RRM)和DAZ重复序列;与黄牛氨基酸序列的同源性为98.65%,仅在C-末端有4个氨基酸的差异,典型结构域的氨基酸序列和高级结构相同.RT-PCR发现b-Boule基因在黄牛和黄犏牛睾丸组织中特异表达,原位杂交显示b-Boule存在于初级精母细胞和次级精母细胞的细胞质中.荧光定量PCR发现黄牛睾丸组织中b-Boule基因表达水平显著高于黄犏牛(P<0.05),且黄犏牛精子发生减数分裂阻滞的表型与人、小鼠BDule基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,因此推测b-Boule基因可能在精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用,且与黄犏牛雄性不育有密切的关系.     

牦牛远缘杂种雄性不育的研究现状

牦牛与普通牛种间杂交可提高牦牛的生产性能,但存在杂种雄性不育的问题,无法稳定利用其杂种优势,因此,雄性不育机制的研究一直是牦牛学的研究热点之一.本文综述了近几十年来有关牦牛与普通牛的雄性杂种的生殖器官的解剖学与组织学结构、精子发生过程、脑垂体的结构与功能、促性腺激素的分泌调控、精子发生相关基因以及可育性恢复的尝试方面的研究进展.     

睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接的研究

采用RT-PCR方法从牦牛、狗和大鼠睾丸组织中克隆睾丸特异乳酸脱氢酶-C（LDH-C）基因的cDNA序列,结果在3种动物中均发现了4或5种Ldhc剪接体,包括外显子缺失或内含子增加两种类型,其中外显子缺失数量为1或2个的比例高．3种动物中外显子缺失的比例由高到低依次为外显子5,4,7,6;狗和大鼠剪接体中额外增加的内含子部分序列均导致在内含子中提前形成终止密码子;对牦牛和狗睾丸组织LDH同工酶的电泳分析未检测到潜在的多种Ldhc剪接体的表达,推测睾丸组织Ldhc选择性剪接的功能是调控该基因在睾丸中表达的方式之一;用RT-PCR方法克隆牦牛肌肉和心脏组织Ldhc基因,意外检测到Ldhc的两种剪接体,提示Ldhc基因的选择性剪接可能参与睾丸以外的其他组织沉寂Ldhc基因的表达．     

犏牛雄性不育的多基因遗传不平衡假说

根据犏牛雄性不育的研究结果，提出了犏牛雄性不育的多基因遗传不平衡假说．假说认为，不育性是受多基因控制的，牦牛和普通牛由于在多个基因位点上的遗传差异而使犏牛的基因平衡失调，导致不育．最后对该假说的部分证据进行了讨论和分析     

犏牛精子发生水平的研究

采用睾丸减数分裂分析方法，对犏牛的精子发生受阻情况进行研究，并讨论了其受阻原因．结果表明，犏牛精子发生存在各个时期的生殖细胞，但从精母细胞开始以后逐级受阻，其精子生成效率比牦牛及普通牛分别低１３～１５个百分点和１７～１９个百分点，仅为０．０９％     

九龙牦牛CAST基因部分序列的克隆及其表达差异研究

根据牛钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST） 设计并合成一对引物,从九龙牦牛肌肉组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增获得九龙牦牛CAST基因部分片段,利用SQRT-PCR技术检测九龙牦牛各组织中CAST mRNA的表达差异．结果,成功克隆九龙牦牛CAST部分cDNA序列485bp,获得GenBank登录号为FJ483833;用DNAman软件分析发现九龙牦牛CAST基因与普通牛的核苷酸同源性依次为99％;SQRT-PCR组织表达检测表明,CAST基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪中均表达,在心脏中表达最高,在脂肪组织中表达最低．     

一条在人睾丸中高表达的新的环指蛋白(RNF20)

从人胎脑构建的cDNA文库中,通过大规模测序筛选的方法获得一条新基因,该基因蛋白序列含有1个环指（RING finger)基序及2个进核信号（nuclear localization signal NLS)序列,钭此基因命名为RNF20（RING Finger 20),用放射杂交细胞系（Radial hybrid RH)方法定位此基因在人染色体的9q22上,Northern杂交表明,其mRNA在睾丸组织中高表达,用小鼠睾丸做原位杂交表明,小鼠的同源基因在精原细胞及初级精母细胞中高表达,未成年小鼠睾丸中的精原细胞没有发达,提示RNF20可能参与精子发生的调控作用。     

牦牛、犏牛和黄牛生产性能比较及肉中风味物质测定

随机选取青海省1．5岁左右牦牛（♂）、犏牛（♂）和黄牛（♂）各3头,利用高效液相色谱法对其肉中的肌苷、肌苷酸和硫胺素进行测定,采用高氯酸滴定法测定其肉中谷氨酸钠的含量,并对牦牛、犏牛和黄牛的生产性能进行比较分析。结果表明：①犏牛的体重和体高明显优于同龄牦牛（P〈0．05）,而且犏牛的体长与牦牛具有极显著差异（P〈0．01）,犏牛和黄牛的胸围都与同龄牦牛具有显著差异（P〈0．05）。②犏牛的头重明显高于同龄牦牛（P〈0．01）;犏牛的皮重、前二蹄重、后二蹄重、胴体重和胴体肉重明显优于同龄牦牛（P〈0．05）;犏牛和黄牛的胴体骨重都与同龄牦牛具有显著差异（P〈0．05）;三个品种的屠宰率、净肉率和胴体产肉率无显著差异（P〉0．05）;黄牛的骨肉比明显高于同龄犏牛（P〈0．05）。③牦牛肉中肌苷含量最高,其含量明显高于同龄黄牛（P〈0．05）;肌苷酸的含量在三品种间无显著差异（P〉0．05）;犏牛肉硫胺素的含量明显高于同龄黄牛（P〈0．05）;黄牛和犏牛肉谷氨酸钠的含量显著高于同龄牦牛（P〈0．05）。     

C57小鼠胸腺和睾丸中roPer1基因启动子区CpGs甲基化分析

利用实时定量PCR方法检测胸腺和睾丸组织中roPer1基因表达时相特点,采用亚硫氢酸修饰法对两种组织两个时间点该基因2个启动子区域5个E-boxCpGs甲基化情况进行研究．结果显示：C57BL／6J小鼠胸腺和睾丸组织中mnrl基因表达没有显著波动性,roPer1基因启动子区CpGs呈低甲基化状态（〈10％）．两种组织中E3和E4甲基化频率存在显著差异（P〈0．01）．在睾丸中,不同时间点E3和E4甲基化频率有显著变化（P〈0．01）．说明在睾丸中,roPer1启动子E-box3的甲基化状态能够随时间波动．但在胸腺和睾丸中,甲基化并不是roPer1基因调节的主要方式．     

基因CR43905敲除对果蝇精子发生和生育力无明显影响

目的:探究睾丸特异表达的非编码基因CR43905在果蝇精子发生和生育力中的生理功能。方法:通过qRT-PCR检测CR43905在果蝇不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CR43905敲除的果蝇品系并通过Sanger测序验证基因组DNA水平的缺失;进一步通过相差显微镜和免疫荧光染色方法观察和形态学分析果蝇CR43905缺失对精子发生的各个阶段生精细胞形态的影响;通过生育力测试实验检测CR43905缺失对雄蝇生育能力的影响。结果:果蝇CR43905是一个睾丸特异表达的非编码基因;利用CRISPR/Cas9技术成功获得了CR43905突变的果蝇品系;果蝇CR43905缺失对精子发生中各阶段生精细胞和雄性生育能力无明显影响。结论:非编码基因CR43905对于果蝇精子发生和雄性生育力的维持是非必需的。     

牦牛雌激素受体ERα和ERβ基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异.根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布.结果表明,分别获得2 100 bp ERα(Gen Ban K登录号:KJ011123)和1 791 bp ERβ(Gen Ban K登录号:KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸.多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5%和53.9%-99.1%.荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ.此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低.而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之,心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低.为进一步了解牦牛ERα和ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础.     

牦牛雌激素受体ERα和 ERβ 基因分子特征及组织表达研究

为研究牦牛雌激素受体(ERα和ERβ)基因序列特征及其在不同组织中的表达差异。根据NCBI上已公布的普通牛ERα和ERβ基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆麦洼牦牛ERα和ERβ基因序列,同时利用荧光定量PCR技术检测ERα和ERβ基因在牦牛不同组织的表达分布。结果表明,分别获得2 100 bp ERα(GenBanK登录号：KJ011123)和1 791 bp ERβ(GenBanK登录号：KJ011124)基因序列,其中ERα的ORF为1 658 bp,编码596个氨基酸,ERβ的ORF为1 584 bp,编码527个氨基酸。多重序列分析表明,牦牛ERα和ERβ与普通牛、原鸡、人、小鼠、大鼠、扬子鳄、蟾蜍及斑马鱼的氨基酸序列同源性分别为45.3%-99.5% 和 53.9%-99.1%。荧光定量PCR结果显示,ERα和ERβ基因在牦牛的各种组织中均有表达,且除睾丸外,ERα在输卵管、子宫及乳腺中的表达高于ERβ。此外,就ERα而言,ERα在牦牛乳腺中表达最高,子宫、输卵管及卵巢次之,心、肝、脾、肺、肾及睾丸相对表达较低。而牦牛ERβ基因在卵巢中表达最高,子宫和输卵管次之, 心、肝、脾、肺、肾、睾丸及乳腺表达较低。本研究为进一步了解牦牛ERα 和 ERβ基因的生物学功能及其分子繁殖机制提供了基础。     

基因功能区域的DNA甲基化分析

基于人类9种细胞系和15种组织的单碱基精度的甲基化数据,计算了基因范围六个功能区域(转录起始区域、第一外显子、中间外显子、最后外显子、内含子和转录终止区域)的甲基化水平,分析了各功能区域甲基化的分布.采用离散增量和欧式距离两类参数分别计算了细胞系和组织间的基因的甲基化差异,并对具有较高差异水平的前20个基因在六类细胞系的表达进行了分析.