大鼠乳酸脱氢酶辅酶结合结构域的克隆与表达

为了研究分离结构域的结构与功能关系 ,利用聚合酶链式反应 (PCR)方法分离出大鼠肌肉乳酸脱氢酶的N端编码 1～ 16 3位氨基酸的辅酶结合结构域的基因片段 .此结构域分别在热诱导表达系统和融合表达系统中获得高效表达 ,两系统获得的单独结构域经N端序列分析表明表达正确 .有关辅酶结合结构域工作正在进行 .     

拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析

通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.     

水稻WRKY89中的亮氨酸拉链结构增强蛋白与W盒元件的相互作用

WRKY蛋白是一类参与植物生物和非生物胁迫反应、代谢、发育等过程的转录调节因子. 水稻WRKY89与其他的WRKY成员同源性较低, 推测由263个氨基酸组成, 其N端带1个可能的亮氨酸拉链结构. 采用pET-29b载体原核表达了OsWRKY89和其3个N端缺失的衍生物, 并采用Ni柱的方法对表达的蛋白进行了纯化. 凝胶阻滞结果表明, OsWRKY89能与含顺式元件W盒的DNA序列特异结 合, 而缺失N端亮氨酸拉链的OsWRKY89与该元件的结合能力显著下降. 酵母双杂交结果表明, 亮氨酸拉链样结构参与OsWRKY89蛋白的同源相互作用. 进一步缺失OsWRKY89至部分WRKY结构域导致表达的蛋白完全丧失与上述元件的结合活性, 表明WRKY结构域是DNA结合中不可缺少的. 这些结果说明亮氨酸拉链结构在蛋白质与蛋白质互作和DNA与蛋白质中起重要作用.     

苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因的鉴定及其在根毛发育中的功能

通过5′RACE扩增了苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因cDNA的5′末端序列.典型的膜联蛋白由一个N端结构域和一个C端保守的核心结构域组成,核心结构域一般含有4或8个由70个氨基酸组成的重复单元,而MtAnn3蛋白的核心结构域仅有1个重复单元.在洋葱表皮细胞中瞬时表达MtAnn3蛋白,揭示其具有细胞膜结合的特性.借助农杆菌介导的苜蓿转化实验表明,过表达MtAnn3的根部在不含Ca2+的培养基上生长,改变了根毛的极性,根毛顶端膨大变形,有时出现分叉现象.在农杆菌介导的MtAnn3启动子-GUS实验中,外源植物细胞分裂素可以诱导MtAnn3启动子的增强表达;接种苜蓿中华根瘤菌进行结瘤实验,启动子在根瘤原基和幼嫩根瘤中有较强的活性,而在成熟根瘤中活性较低,在衰老的根瘤中检测不到启动子活性.虽然MtAnn3在根瘤中的表达具有一定的时序性,它却不是瘤特异性的,它在苜蓿的根、茎、叶中都有高水平的转录表达.     

巴西固氮螺菌NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌（Azospirillum brasielense）NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用。结果表明：PⅡ蛋白能和完整NifA蛋白自身或其N－端结构域特异结合，不能与NifA的中间或C－端结构域相互作用；与PⅡ蛋白高度同源的Pz蛋白（即GlnK）也不能与NifA结合。将编码PⅡ蛋白的glnB基因进行移码突变后，突变的PⅡ蛋白失去了与NifA蛋白结合的功能。这说明NifA确实可与PⅡ蛋白特异地结合，但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析。     

拟南芥动蛋白基因AtKP1的克隆、表达及生物化学特性分析

动蛋白(kinesin)种类很多, 在真核细胞中行使多种功能. 利用3′-RACE 技术从拟南芥中克隆了动蛋白-14B 亚家族中的一个成员, 命名为AtKP1 (拟南芥动蛋白1). 其最大可读框为3.3 kb, 编码1087个氨基酸. 结构域分析表明,AtKP1多肽链中部有一个马达结构域, 氨基端有一个CH结构域, 羧基端一个含有202个氨基酸残基的序列表现出很强的特异性. Northern印迹表明, AtKP1基因在各种器官中广泛表达, 但在幼苗中表达量最大. 将克隆的长度为2808 bp的AtKP1启动子区域与GUS 基因进行了融合, 转基因分析显示, AtKP1主要在幼嫩器官维管束和幼叶表皮毛中表达, 表明AtKP1可能参与了维管束和叶表皮毛的分化或发育. 对AtKP1的马达结构域进行了原核表达和亲和纯化, 生物化学特性研究表明这个马达结构域可以核苷酸依赖的方式与微管结合, 且具有微管激活的ATP酶活性.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

巴西固氮螺菌GlnB与NifA蛋白N端结构域的相互作用

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可与多种重要作物联合固氮, 具有作为生物肥料的潜能. 固氮基因(nif)的转录激活蛋白NifA和PⅡ信号转导蛋白家族成员GlnB是参与该菌固氮调控的两个关键蛋白, 且NifA的活性调控依赖于GlnB. 研究结果表明, 在无氮条件下GlnB与NifA蛋白N端结构域存在相互作用, 且N端18和53位酪氨酸突变为苯丙氨酸的NifA与GlnB的互作增强. 研究还发现, NifA蛋白N端66~88位和165~176位氨基酸区域对于与GlnB蛋白的相互作用是必需的.     

巴西固氮螺菌NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasielense)NifA与P_Ⅱ蛋白之间的相互作用. 结果表明: P_Ⅱ蛋白能和完整NifA蛋白自身或其N-端结构域特异结合, 不能与NifA的中间或C-端结构域相互作用; 与P_Ⅱ 蛋白高度同源的Pz蛋白(即GlnK)也不能与NifA结合. 将编码P_Ⅱ蛋白的glnB基因进行移码突变后, 突变的P_Ⅱ蛋白失去了与NifA蛋白结合的功能. 这说明NifA确实可与P_Ⅱ蛋白特异地结合, 但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析.     

类DnaJ蛋白基因sll1384参与集胞藻PCC 6803的趋光反应

在集胞藻PCC 6803中, 基因sll1384编码的蛋白在N端含有一个DnaJ结构域, C端含有一个TPR结构域. sll1384突变株对不同温度的适应能力同野生型没有区别, 但其趋光运动能力几乎丧失. 将野生型sll1384基因导入突变株后, 可恢复其向光运动. 电子显微镜观察发现, 突变株细胞表面的纤毛与野生型没有明显区别. 突变株的转化效率也与野生型相同, 推测Sll1384通过与其他蛋白相互作用调节集胞藻的趋光反应. 这是在蓝藻中发现的第一个影响趋光反应的类DnaJ蛋白基因.     

白芷细胞外ECBP21全长cDNA克隆

ECBP21是从白芷悬浮培养细胞外检测并纯化的一种依赖钙的钙调素结合蛋白。利用RT－PCR和5‘-RACE方法，获得其cDNA全长。ECBP21 cDNA全长947bp，编码216个氨基酸，其中N端1－25氨基酸为信号肽，26－216氨基酸为成熟蛋白肽段，而且26－45氨基酸序列与纯化ECBP21N末端测序结果完全一致。将此cDNA成熟蛋白编码区核苷酸片段导入pET-28b( )表达载体中，并在大肠杆菌表达系统中诱导表达，经CaM-Gel overlay检测证实表达蛋白具有Ca^2 依赖的钙调素结合特征，从而进一步证实了cDNA克隆的正确性。这为进一步用分子生物学方法研究植物细胞外多肽ECBP21的生物学功能奠定了基础。     

人HGLP cDNA的克隆和原核表达

克隆了人HGLP cDNA,编码蛋白具有G蛋白偶联受体类似的7个跨膜区,具有视紫红质样G蛋白偶联受体超家族的基序（motif).Northern杂交分析发现HGLP广泛表达。将HGLP的N,C端非跨膜区片段克隆到pET30a^ 表达载体中,在E.coli中获得了高效表达。     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

水稻中一个25 kD Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的表达和抑制活性分析

水稻Bowman-Birk 蛋白酶抑制剂(RBBI)在体外是胰蛋白酶抑制剂, 有的有1 个同源结构域 (8 kD), 有的有2 个同源结构域(16 kD). 本研究发现, 在水稻体内存在带有3 个同源结构域的RBBI(25kD), 而且RBBI 受发育和伤害调控. 体外实验发现, 3:13 二硫键(而不是4:5 二硫键)可抑制胰蛋白酶的活性; 而RBBI3-1 的D3 结构域对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌素没有抑制活性. 突变实验表明, 改变D1 结构域N 端的P1 位点(把Lys 突变为Leu)并不能获得对胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这表明RBBI3-1 的D1 结构域反应回环阻碍了P1 位点获得新的抑制活性; 而对胰凝乳蛋白酶的抑制活性可能还需要其他结构(比如3:13 二硫键)的参与.     

BICP0和其环指结构域具有E3泛素连接酶活性

1型牛疱疹病毒(BHV-1)早早期(immediate early, IE)基因所编码的调控蛋白BICP0可决定病毒的感染方式, 具有多种转录调控功能. 它能促进病毒自身IE基因、早期(early, E)基因和晚期(later, L)基因以及其他一系列细胞基因的表达. 为研究其作用机理, 在E. coli中表达纯化了BICP0及其各种缺失突变蛋白. 体外活性实验表明, BICP0全长蛋白和其具有环指(ring finger)结构域的N端蛋白可以催化多聚泛肽链的形成, 具有E3泛素连接酶的功能, 暗示BICP0的转录激活功能可能通过其泛素连接酶功能实现, 为阐明BICP0在病毒感染中的作用机理提供了新视角.     

应用多波长反常散射法测定耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的晶体结构

运用基因工程技术,将耐热邻苯二酚2,3－双加氧酶（TC23O）分子中的甲硫氨酸（Met）全部置换为甲硒氨酸（SeMet）。培养出甲硒氨酸置换的耐热邻苯二酚2,3－双加氧酶（SeMet-TC23O）的晶体,利用同步辐射光源收集了SeMet-TC23O晶体的X射线衍射数据,应用多波长反常散射方法测定了TC23O0.3mm的晶体结构。结果显示,TC23O分子为同源四聚体结构,每个单体由相对独立的N－端结构域（1－153位氨基酸残基）和C－端结构域（153－319位氨基酸残基）构成。每个结构域含有两个在此类酶中具有特征性的βαβββ结构花样,两个结构域可根据分子内非晶体学对称轴近似叠合。     

拟南芥液泡膜水孔蛋白的互作蛋白AtSM34 参与种子萌发的渗透胁迫响应

水孔蛋白(aquaporin, AQP)广泛参与植物的各种生理活动, 但还有许多调控机制未被发现. 为进一步对其调控因子进行研究, 运用酵母双杂交筛选拟南芥液泡膜水孔蛋白TIP1;1(tonoplast intrinsic protein, TIP)的互作子, 这是拟南芥中第一个被发现的液泡膜上具有高度水转运活性的蛋白. 以AtTIP1;1 为诱饵, 筛选得到一个新的TIPs 结合蛋白, 并在酵母和植物细胞中验证了这种结合. 该蛋白被命名为AtSM34, 编码一个含309 个氨基酸的多肽, 预测分子量为34 kD, 具有1 个单独的MYB/SANT 样结构域. AtSM34 启动子融合GUS 组织化学染色分析显示, 其表达主要位于花、茎和叶中, 尤其是维管束组织, 并且响应渗透胁迫. AtSM34 定位于内质网, 截断分析显示其N 端(1~83 位氨基酸)对于其定位至关重要. 过表达AtSM34 导致转基因植物对外源甘露醇、山梨醇及脱落酸更加敏感, 表现为萌发延迟. 进一步研究发现,AtSM34 也可与AtTIP1;2 和AtTIP2;1 结合, 这2 个TIP 蛋白对液泡渗透调节发挥着重要作用,并在种子萌发阶段大量表达. 这暗示着AtSM34 可能通过影响水孔蛋白基因的表达, 参与种子萌发早期阶段的渗透胁迫响应.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.