产色链霉菌SY20-2与龟裂链霉菌SY20-4的种间原生质体融合

利用卡那霉素(250μg/mL)、链霉素(1 000μg/mL)和罗红霉素(150μg/mL)标记亲本菌株SY20-2、SY20-4,进行种间原生质体融合.试验结果表明,培养基中加入0.5%~1%甘氨酸可以提高菌丝体对溶菌酶的敏感度,有利于原生质体的释放.溶菌酶不仅影响原生质体的形成,而且影响原生质体的再生率,因此在35℃水浴条件下,SY20-2选择酶浓度2 mg/mL,作用时间30 min;SY20-4选择酶浓度4 mg/mL,作用时间40 min,最适于原生质体的再生.以45%PEG(分子量1 000)作助融剂,融合频率为0.124%,选出153个融合子,其中3株重组子的稳定性及抑菌活性较好,重组子C对烟草野火病菌的抑菌活性比对照要好.     

链霉菌702原生质体的制备和再生条件研究

为了确定链霉菌702菌株原生质体制备和再生较优组合条件,以链霉菌702菌株为试验材料,试验设计以单因素和多因素多水平的正交试验。在单因素试验结果中探索该菌的对数生长期为35 h~50 h,在菌丝体培养基中添加1.0%甘氨酸有利于该菌原生质体制备和再生;正交试验分别以影响该菌原生质体制备和再生的菌丝体培养时间、溶菌酶使用浓度、酶解温度和酶解时间的四因素三水平的L9(34)正交试验,试验表明:链霉菌702菌株原生质制备和再生较优组合为A2B2C3D1,即菌丝体培养时间为43 h,溶菌酶浓度为2.0 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间60 m in,原生质体的制备率和再生率分别达到96.5%和27.8%。本试验为该菌进一步进行原生质体诱变打下良好的基础。     

赤霉素产生菌~#218菌株的研究——Ⅰ.原生质体的分离和再生

赤霉素产生菌~#218菌株菌丝体用玻璃纸平板培养法培养,培养时间为36小时。采用2%蜗牛酶,不须硫醇类化合物预处理,可直接裂解赤霉素产生菌~#218菌株菌丝体,得到大量的原生质体。将原生质体悬浮液接种到高渗性再生培养基上,再生频率约为1～2%。原生质体再生菌株仍保留亲株的菌落形态及合成赤霉素的生产能力。     

利用原生质体融合技术选育高产菌株

以龟裂链霉菌(Sterpomyces rimosus)98#和76#为出发菌株,分别用溶菌酶制得2个亲本的原生质体,其中76#采用15 W紫外灯下30 cm照射25 min,100 %灭活,用PEG诱导进行了原生质体的融合.通过比较菌落外观、颜色挑选融合子328株,结合前期代谢情况进一步筛选高单位的融合菌株8株,经反复传代考察融合子的稳定性后得到1株新菌株102#,其发酵单位比亲本提高了13.0%.     

洁霉素产生菌原生质体的形成、再生和融合

洁霉素产生菌不论生长在含有甘氨酸的S培养基或不含甘氨酸的S培养基的菌丝中,其细胞壁均可被溶菌酶溶解而释放出原生质体。甘氨酸浓度为1.0%破壁效果最好,溶菌酶的作用浓度以2.5mg/ml为最佳。原生质体在Hb培养基上能够很好地再生。用P培养基配制的40%(w/v)PEG1000溶液,能有效地诱导洁霉素产生菌原生质体融合。融合重组频率达6.7%。     

黑暗链霉菌与卡那链霉菌原生质体融合研究

进行了黑暗链霉菌与卡那链霉菌原生质体融合实验 .结果表明 ,将孢子悬浮液接种于种子培养基 ,然后转移到含 0 .5 %Gly的菌丝体培养基收获的菌丝体对形成原生质体最有利 .分别采用 10mg mL、6 0min及 5mg mL、75min的溶菌酶浓度与酶解时间制备黑暗链霉菌与卡那链霉菌原生质体能达到较高的形成率和再生率 .采用单亲灭活卡那链霉菌原生质体的种间融合法 ,得到与亲株形态明显不同的杂合体菌落 ,并筛选到44株妥布霉素产率提高的菌株 ,幅度最高达到 39% .     

链霉菌种间原生质体融合的研究

金霉素链霉菌和龟裂链霉菌分别在含０．７５％，甘氨酸１．５０％的液体培养基中培养，对数生长中后期的菌丝体易于制备原生质体，当聚乙二醇（ＰＥＧ６０００）浓度为４０％，在５０℃下保温５ｍｉｎ，有效地诱导了两种原生质体的融合。用表型标记和间接选择的方法检出融合子，种间融合率为３．０５％。融合重组体与亲本在菌落形态，孢子形态，抗生素产量和抗噬菌体特性有显著的差异，不同重组体之间也表现了这些差异．     

降解聚乙烯醇菌株原生质体的制备及融合

从自然界中分离得到 4株能降解聚乙烯醇 (PVA)的细菌 ,经紫外线诱变 ,得到两株具有单重抗药性的突变菌株S7(Strr,Kans)和K15 (Strs,Kanr) .系统分析了各种因素对原生质体制备率以及再生率的影响 ;将S7和K15作为亲本菌株进行原生质体融合 ,并通过正交试验 ,对原生质体融合的条件进行优化 ,使融合率达到 4 .6 0 3× 10 - 5.融合子F4菌株培养成活性污泥后 ,PVA降解率可达 87% ,是普通活性污泥的 3～ 4倍     

米曲霉与黑曲霉原生质体种间电融合杂交育种

研究了培养基、菌龄、缓冲系统、渗稳剂、酶系统等因素对米曲霉和黑曲霉原生质体制备和再生的影响，探讨了电融合的最佳条件。通过种间原生质体电融合，得到了稳定的重组子。测定了融合子的生长速度、蛋白酶活性和酯酶同工酶酶谱，与亲本进行比较，得到两株生长较快、蛋白质酶活性较高的融合菌株，拮抗实验表明，他们是不同于亲本菌的新菌种。     

他克莫司产生菌原生质体制备、再生与诱变

对筑波链霉菌的原生质体制备、再生条件进行了研究,建立了筑波链霉菌的原生质体诱变筛选体系.在此基础上,通过原生质体的紫外诱变处理,筛选得到1株高产菌株,与出发菌株相比,该菌株的平均发酶单位提高51.4%.通过原生质体的紫外诱变来筛选他克莫司高产菌株是一种行之有效的方法.     

斜卧青霉Penicillium decumbens原生质体的形成和再生因素的研究

用脱壁酶(含0.04％的蜗牛酶和0.5％的纤维素酶)以0.6M的(NH_4)_2SO_4作稳定剂,于pH6.5,35℃直接酶解不经任何预处理的培养22～25小时和33～36小时的斜卧青霉JN15、Jul的菌丝体,得到大量具再生能力的原生质体。用不同浓度的脱壁酶处理指数生长期的菌丝体,在本试验范围内,原生质体的形成量随酶浓度的增高而增加,其再生频率随酶浓度的升高而下降;对两者的关系进行了讨论,并给出了获得大量具再生活性的原生质体的脱壁酶的浓度范围。同时,研究了温度,pH、渗透压稳定剂的浓度对原生质体形成和再生的作用;在相差显微镜下,详细观察了原生质体的释放过程、形态变化以及原生质体再生成正常茵丝的全过程。     

玉米叶片原生质体的制备

本文以玉米黄化叶片为材料，采用两步酶解的方法研究了从玉米叶片制备原生质体的方法，发现第一次酶解以３０℃处理１ｈ为宜，第二次酶解以３０℃处理２．５～３ｈ较合适。同时发现所得原生质体净化悬浮时用２５％的蔗糖溶液在２５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ能获得较好的净化效果。     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用

设计切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酸Rz－2，分别以pKyLx7和pBin19为载体，构建含Rz－2基因及核酸和底物连接的RzSb－2基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ti质粒．重组Ti质粒通过PEG法转化烟草原生质体，同时对转化的原生质体接种TMVc一定时间后以半叶法检测原生质体中病毒的侵染性．结果表明转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照，推测病毒在转基因的原生质体中复制受到干扰；且核酸Rz－2（正向）表达后作用最为明显，核酸连底物RzSb－2（正向）与RzSb～2（反向）之间有明显差别．     

紫锥菊愈伤组织原生质体分离方法初探

紫锥菊提取物属于目前国际上流行的草本植物药,其主要运用于增强免疫力等方面.以加拿大狭叶紫锥菊愈伤组织为材料,研究影响其原生质体分离的因素,结果表明选用浅黄绿色、质地均匀且呈疏松颗粒状的紫锥菊愈伤组织易游离出原生质体;采用纤维素酶浓度为2.0%,果胶酶浓度为1.0%,半纤维素酶浓度为0.5%,甘露醇浓度为0.7 mol·L-1的酶液配方酶解时间为8 h时,原生质体的产量为每克鲜重含50.0×104个.由此归纳出一套完整的愈伤组织诱导,组织培养,原生质体分离纯化,原生质体鉴定及计数的方法.     

稗弯孢菌（Curvularis lunata）原生质体的制备

研究了不同菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂、缓冲液pH值以及酶解温度和时间等因素对稗弯孢菌(Curvularia lunata)原生质体形成的影响。将培养18h的菌丝,以0.7mol/L KCl作为渗透压稳定剂,30℃下,经过2％溶壁酶和4％纤维素酶混合酶液(pH5.8)酶解4h,原生质体在静止条件下最大释放量达到 1.7×10~6/mL,再生率为0.76％。     

阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)原生质体制备与再生的研究

阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)在经0.4％巯基乙醇30℃预处理15分钟的菌丝体,其菌龄以对数期为宜。在蜗牛酶浓度8mg/ml、纤维素酶0.lmg/ml及果胶酶0.05mg/ml的作用下,pH为6.0～7.5,以0.7M甘露醇或0.gM蔗糖作稳定剂,有利于此种酵母原生质体的制备和再生.     

播娘蒿原生质体培养研究

以播娘蒿无菌苗的子叶和下胚轴分离原生质体 ,每克鲜重产量最高达 ( 1～ 1 5 )× 10 6 个 .对原生质体进行液体浅层静置培养 .结果表明 :最佳酶解液酶组成为 4 %纤维素酶 + 2 %果胶酶 + 0 5 %离析酶 ;最佳培养密度为2 0× 10 4个 /mL ;最佳渗透压稳定剂为 10 %蔗糖 + 2 %葡萄糖 .观察表明 :播娘蒿原生质体 1～ 7d内出现第一次分裂 ,分裂频率约 2 0 %,培养 18d时具几十个细胞的细胞团 ,以后逐渐形成肉眼可见的小愈伤组织 .     

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)营养缺陷型的筛选及原生质体融合

本文采用营养缺陷型的互补进行了啤酒酵母原生质体融合产物的筛选。从DNA含量分析看,融合子多为三倍体,少数为四倍体,融合子的生长速度和酒精产率都比亲株高,种内原生质体融合率为1.21×10~(-4)。