紫云英根瘤菌nodD基因的克隆及核苷酸序列

豆科植物紫云英(Astragalus sinicus)是生长于我国南方地区的重要绿肥之一.紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R.astragali)是革蓝氏阴性细菌,感染豆科植物紫云英后形成有效的固氮根瘤.决定根瘤菌在宿主植物引起根瘤的基因称结瘤基因(nod和nol基因),nod和nol基因的诱变将导致根瘤菌不能或延迟在宿主植物上结瘤.这些基因包括共同结瘤基因nodABC,nodIJ.宿主专一性结瘤基因(hsn)nodEF,nodG,nodH,nodQ等及与结瘤有关的一些nol基     

结瘤基因群调控蛋白Nod D在DNA分子上的结合位点的测定

豆科植物和根瘤菌协同进行共生固氮,是自然界将游离的N_2转化成有机NH_3的主要途径之一。共生固氮只有在根瘤内环境中才能进行。通过转座突变、重组克隆和转化等一系列实验后发现,共生固氮菌中存在着一群特定的基因——结瘤nod基因,它们引起植物根部结瘤,并决定寄主的专一性。不同根瘤菌内的nod基因数量虽然不同,但一般不超过十多个。     

发现一个倒位重复DNA序列为结瘤基因转录所必需

豌豆根瘤菌R.leguminosarum中有13个基因参与豌豆根部的结瘤.这些基因统称为结瘤(nod)基因.在这些nod基因中有一个称为nodD的调节基因.nodD至少有2个功能:(1)它的产物NodD蛋白抑制nodD自身的转录,称为自身调控(autoregulation);(2)当有植物分泌的类黄酮存在下,NodD又激活全部其它nod基因的转录.我们的研究发现:(1)除NodD外,     

紫云英根瘤菌基因文库的构建和结瘤基因片段的分离

根瘤菌(Rhizobium)与寄主豆科植物的共生涉及到根瘤菌和植物之间的识别;根瘤菌的浸染;根瘤的形成;根瘤菌类菌体的发育等一系列复杂的过程。 在苜蓿根瘤菌(R. meliloti)中决定引起根瘤的结瘤基因(nod gene),目前已经鉴定出nodA,B,C,D。因为这类基因在多种根瘤菌中都被找到,而且在功能上可以互补,所以     

苜蓿根瘤菌nod C蛋白生化特性的分析

根瘤菌的共同结瘤基因nod A,B和C,具有高度的保守性。这些基因对诱发宿主根毛的卷曲和根瘤早期的形成起重要作用.比较苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)和碗豆根瘤菌(R. Leguminosarum)结瘤基因的DNA序列,由此得出nod C蛋白(Nod C)的氨基酸顺序同源性达95％。最近开始对结瘤蛋白生化功能的研究表明,Nod C的结构同细胞表面受体非常类似。     

结瘤基因调控区中多个活性位点的发现

豆科植物的结瘤是共生生物固氮的首要环节。在豌豆根瘤菌中已鉴定出13个结瘤基因,它们的活动促成豌豆根部结瘤。在这些基因中有一个调控基因nodD。在植物分泌的信号分子——类黄酮的存在下,nodD基因的产物NodD蛋白对其它结瘤基因的活动起着重要的调     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节niffix基因的表达,同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因,通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii NH01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA,研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响,研究结果发现,引入KpnifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力,同时初步试验结果证实,带额外nifA的大根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性,推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段,由于结瘤因子是诱导主形成根瘤的主要信号分子,而结瘤过程具有自我调节作用,植株一旦结瘤,就会抑进一步结瘤,因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率。     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）固氮调节基因ｎｉｆＡ对大豆根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＨＮ０１ｌｕｘ的结瘤固氮效率有促进作用。首先构建一个带有Ｋｐ ｎｉｆＡＨ的重组质粒ｐＸＤ１,使ｎｉｆＡ在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达。当质粒ｐＸＤ１转移至大豆根瘤菌ＲｆＨＮ０１ｌｕｘ后,获得带Ｋｐ ｎｉｆＡ的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显     

苜蓿根瘤菌nodD3P1启动子下游序列的调节功能

苜蓿根瘤菌结瘤正调节基因ｎｏｄＤ３的Ｐ１启动子到编码区间有一长６６０ｂｐ的序列,称为Ｐ１下游序列,内含有两个潜在的开发放阅读框,即ＯＲＦ１和ＯＲＦ２,其中ＯＲＦ２可编码一个含８６个氨基酸残基的多肽。     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

中国生物固氮研究现状和展望

生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一, 它在生产实际中发挥着重要作用: 为植物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展. 本文在介绍国际生物固氮研究进展的同时, 着重叙述了生物固氮研究取得的重大进展和成果: 收集了根瘤菌资源, 建立了最大的数据库, 修正和发展了国际上对根瘤菌的分类; 发现了固氮基因, 证实了克氏杆菌固氮基因操纵子的连锁性及正调控基因的调节机制和对氧、温度的敏感性; 发现苜蓿根瘤菌结瘤调控基因nodD3的产物对结瘤基因表达的启动不受宿主类黄酮的作用; 发现苜蓿根瘤菌的碳利用基因和固氮生物氮代射和碳代谢基因表达及其调节的偶联作用; 化学合成了根瘤菌的结瘤因子; 在固氮基因表达调节基础上, 构建了固氮基因工程菌株, 并在生产中得到应用; 提出了化学模拟固氮酶的结构和功能, 固氮酶活性中心的模型和合成了模型化合物, 受到了国际高度评价. 根据国际上研究的趋势并结合国内的研究进展, 提出了生物固氮研究的发展方向, 建议在联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其提供氮素的作用, 根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用, 氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联与共生结瘤固氮中功能基因组学等方面展开积极研究.     

弗兰克氏菌固氮基因片段的分离及其比较

弗兰克氏菌和放线菌结瘤植物(actinorhizal plants)之间的共生与根瘤菌和豆科植物间的共生有很多相同点:如侵染过程、瘤结构形态和固氮效率等;但同时它又比根瘤菌有更广的寄主植物范围(涉及8科至少23属200多个种),远远超出了根瘤菌寄主范围的限制,因此被认为是研究有关共生基因特别是与寄主专一性有关的基因的很好的材料。自1978年第一株     

紫云英参与共生固氮的2个新结瘤素基因的分离与鉴定

通过抑制差减杂交, 比较了接种华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R的紫云英(Astragalus sinicus)的根与未接种根瘤菌的对照根在转录水平上的差异, 建立了紫云英共生结瘤过程中的差异表达基因文库, 并在此基础上证实了2个结瘤特异性基因AsⅡC259和AsG2511. 其可读框显示, AsⅡC259和AsG2511编码的多肽链长度分别为134和58个氨基酸, 其氨基端均含有一个信号肽. 结构域查询结果揭示, AsⅡC259编码的多肽链包含了2个N-糖基化位点、一个依赖于cAMP的蛋白激酶(PKA)和cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)磷酸化位点以及一个酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点. BlastP同源搜索表明, AsⅡC259多肽链仅与一个来自羽扇豆(Lupinus luteus)根瘤的新结瘤素蛋白表现出较低的同源性. 对于AsG2511多肽链, 没有发现任何明显的同源序列. Virtual Northern blot和半定量RT-PCR分析表明, AsⅡC259和 AsG2511均只在接种根中表达, 说明它们确为结瘤特异性基因; 另外, 这2个基因的表达比豆血红蛋白基因晚2~4 d, 应为晚期结瘤素基因.     

紫云英根瘤菌nif DNA的分子克隆

固氮微生物中涉及到与固氮作用有关的基因的研究已有详细的报道. 共生固氮根瘤菌中参与固氮作用的基因有二类,一类是与肺炎克氏杆菌Kp nif基因有同源性的基因——nif基因,另一类是在共生状态进行固氮作用所必需的其它基因——fix基因.根瘤菌中nif与fix基因中的任何一个基因发生突变,根瘤菌虽仍感染宿主发育成根瘤,但不能固氮.     

苜蓿根瘤菌1021外源cAMP上调glnⅡ及glnK-amtB的表达

苜蓿根瘤菌1021中多个腺苷酸环化酶基因的存在, 暗示着cAMP的重要性. 本研究用全基因组DNA微阵列分析了外源cAMP对苜蓿根瘤菌的功能. 分析结果表明, glnⅡ和glnK的转录水平在外源cAMP存在时有明显上调. 通过测定glnⅡ和glnK启动子与lacZYA报告基因融合系统在苜蓿根瘤菌体内的活性, 再次证实外源cAMP对glnⅡ和glnK启动子表达有激活作用.     

固氮细菌找到新寄主

研究人员促成了固氮根瘤菌到包括稻子在内的非豆科植物的根际安家结瘤.固氮根瘤菌是一种极其特别的细菌.除个别例外,它们只能在豆科植物例如大豆,苜蓿和刺槐的根部结瘤固氮.这种细菌,摄取在空气中无用的氮气,并将其转化成氨和植物的其他营养成份.实际上,细菌是为     

苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因的鉴定及其在根毛发育中的功能

通过5′RACE扩增了苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因cDNA的5′末端序列.典型的膜联蛋白由一个N端结构域和一个C端保守的核心结构域组成,核心结构域一般含有4或8个由70个氨基酸组成的重复单元,而MtAnn3蛋白的核心结构域仅有1个重复单元.在洋葱表皮细胞中瞬时表达MtAnn3蛋白,揭示其具有细胞膜结合的特性.借助农杆菌介导的苜蓿转化实验表明,过表达MtAnn3的根部在不含Ca2+的培养基上生长,改变了根毛的极性,根毛顶端膨大变形,有时出现分叉现象.在农杆菌介导的MtAnn3启动子-GUS实验中,外源植物细胞分裂素可以诱导MtAnn3启动子的增强表达;接种苜蓿中华根瘤菌进行结瘤实验,启动子在根瘤原基和幼嫩根瘤中有较强的活性,而在成熟根瘤中活性较低,在衰老的根瘤中检测不到启动子活性.虽然MtAnn3在根瘤中的表达具有一定的时序性,它却不是瘤特异性的,它在苜蓿的根、茎、叶中都有高水平的转录表达.     

苜蓿中华根瘤菌烯脂酰ACP还原酶基因fabI1的功能研究

我们先前的工作表明, 苜蓿中华根瘤菌的烯脂酰ACP还原酶基因fabI1在nifA突变根瘤中表达水平降低. 本研究构建了fabI1的定点插入突变体. 与野生型相比, 突变菌株的生长速度变慢, 在高浓度NaCl培养基上的生长能力降低. 在半固体培养基上, 该突变体的涌动能力完全丧失. 在共生过程中, 突变菌株在宿主植物上延迟结瘤, 形成根瘤的能力下降. 虽然苜蓿中华根瘤菌中的烯脂酰ACP还原酶基因fabI2的序列与fabI1有66%的一致性, 但fabI2不能恢复fabI1突变体的表型, 揭示了这两个基因在功能上的差异.