骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究进展

摘要: 由各种因素导致的重症肝病的终末治疗的最好手段一直是原位肝移植,但长期以来肝供体的缺乏和免疫排斥引起的一系列问题极大地限制了该手术的运用,同时,在肝脏相关药物的筛选中,原代肝细胞难于培养且易在培养过程中变异,而随着骨髓间充质干细胞研究的深入,越来越多的证据表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。因此,骨髓间充质干细胞诱导分化而成的肝样细胞在再生医疗和药物筛选领域具有较好的运用前景,本文就间充质干细胞的分离培养及其生物学特性,肝样细胞的诱导培养条件,生物学特性及其运用前景加以综述。     

高糖诱导人脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化

目的:探讨脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化的潜能.方法:分离脐血有核细胞,将其置于MesencultTM培养基中进行培养,并利用贴壁法进行纯化、扩增.扩增后的脐血间充质干细胞用含体积分数5%胎牛血清的H-DMEM持续诱导.采用胰岛素免疫荧光染色对诱导后的细胞进行鉴定,定量检测胰岛素分泌水平及其对葡萄糖刺激的反应性.结果:诱导后,细胞形态发生明显变化,变圆而且聚集成团;细胞的胰岛素免疫荧光染色为阳性;而且细胞能分泌少量胰岛素,并对糖刺激具有反应性.结论:在高糖环境中,脐血间充质干细胞具有向胰岛样细胞分化的潜能.     

小鼠胎肝间充质干细胞体内向骨骼肌样细胞分化的研究

目的:了解小鼠胎肝间充质干细胞在体内向骨骼肌细胞分化的潜能。方法:无菌条件下将C57BL/6 J胎鼠肝脏制成单细胞悬液,雄性胎肝悬液体外贴壁培养纯化,传3代后将贴壁细胞移植于心肌毒素(card iotoxin)造成的雌鼠骨骼肌损伤部位,2月后处死受鼠,取相应骨骼肌组织固定、制片;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝间充质干细胞向骨骼肌样细胞分化情况。结果:在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时呈现骨骼肌组织的部分特征,表型为desm in /F lt-1-/CD4-5/F4-/80。结论:胎肝中分离出的间充质干细胞在体内可以分化为骨骼肌样细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

目的：探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（ＭＳＣs）向胰岛β样细胞分化。方法：在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化。观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞。结果：未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应：双硫腙染色阳性。结论：人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。     

人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养.发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞rMSCs的方法,检测传代细胞的细胞周期,并分析部分细胞表型,对rMSCs进行初步的鉴定。方法:密度梯度离心结合贴壁培养法分离培养rMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原,流式细胞仪检测细胞周期。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,细胞周期显示90.16%P1代细胞处于G0/G1期,免疫组化结果为:CD44、CD29阳性、CD34阴性,说明培养的细胞即非造血干细胞,也非成纤维细胞。结论:本实验分离培养的细胞群与间充质干细胞的生物学特性吻合,说明密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞稳定表达CD44、CD29,是实用、可行的方法,所培养的细胞可用于细胞移植等研究。     

尼古丁对人脐带间充质干细胞氧化应激的影响

目的:研究尼古丁对人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)超微结构及氧化应激的影响,探讨尼古丁诱导HUCMSCs凋亡的作用机制.方法:不同浓度尼古丁作用HUCMSCs后,透射电镜(TEM)观察HUCMSCs超微结构变化.分光光度计法检测HUCMSCs胞内过氧化氢酶(CAT)活性,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,化学比色法检测还原型谷胱甘肽(GSH)活性,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量.分光光度计法检测一氧化氮合酶(NOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性.结果:尼古丁作用HUCMSCs后,细胞内出现大量空泡状结构,粗面内质网扩张成池,线粒体嵴扩张.细胞内CAT、SOD、GSH活性均显著降低,脂质过氧化产物MDA含量显著增加,呈浓度依赖性.NOS、iNOS活性随尼古丁浓度上升而逐渐增加.结论:尼古丁可增加HUCMSCs的NOS、iNOS活性,使细胞发生凋亡结构改变,呈氧化应激状态,发生氧化-抗氧化系统失衡.     

体外分离培养的心脏干细胞具有间充质干细胞的特性

近年来,已报道从成年的小鼠中分离得到心脏干细胞(Cardiac Stem.Cells CSCs),并且应用于心脏病的治疗.但是心脏干细胞特征尚未完全阐述.通过体外分离成年小鼠的心肌组织,进行培养,分离得到半悬浮状态的具有干细胞特性的细胞;利用流式细胞仪检测分离得到的心脏干细胞的表面分子表达情况;并且通过调整培养条件诱导其体外分化.研究结果显示成功分离得到的心脏干细胞,表达干细胞标志分子Sca-1,以及间充质干细胞标志分子(CD29、CD90、CD44和CD106);体外分化研究显示心脏干细胞可以分化成心肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和成骨细胞.心脏干细胞具有间充质干细胞的特性,具有多向分化潜能,在心脏损伤的治疗中具有重要意义.     

骨碎补有效成分柚皮甙对人骨髓间充质干细胞的影响

目的探讨骨碎补的有效成分枘皮甙对人骨髓间充质于细胞（hMSCs）增殖、分化的影响。方法将骨碎补的有效成分柚皮甙以及成骨诱导液（地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠）与hMSCs共同体外培养，用倒置显微镜观察细胞生长情况、CCK-8法检测细胞的毒性和增殖作用、碱性磷酸酶（ALP）活性测定、von kossa钙结节染色。结果50μg／L柚皮甙对细胞无毒性、能促进hMSCs增殖，碱性磷酸酶（ALP）活性、von kossa钙结节染色与卒白对照组比较有明硅差异（P〈0．05）。结论柚皮甙对hMSCs有保护作用并能促进其增殖、分化。     

骨髓间充质干细胞诱导分化视网膜神经样细胞的研究进展

视网膜色素变性及老年性黄斑变性是严重威胁视力的疾病,目前临床上缺乏有效的治疗方法。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)有跨胚层分化能力,在一定的条件下可以向神经细胞分化。大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成为视网膜色素细胞的研究为此类疾病的治疗带来了希望,成为近年来该领域的研究热点。本文对近年来不同培养条件对大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化的影响以及视网膜前体细胞眼内移植的进展综述如下。     

骨髓间充质干细胞三维培养--构建工程组织

骨髓间充质干细胞因其可获得性、可扩增性和可多向分化性,是理想的组织工程种子细胞,用于构建工程组织。实现这一目标的主要障碍在于如何在体外模拟生理环境培养骨髓间充质干细胞,因此,研究并改进骨髓间充质干细胞体外三维培养至关重要。对近年来骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞的培养方式、培养系统以及培养中的环境因素加以评述。     

骨髓间充质干细胞向视网膜光感受器样细胞诱导分化探讨

目的:探讨体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)诱导分化成视网膜光感受器样细胞的能力。方法:用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,利用光感受器细胞培养上清液诱导MSC细胞14 d。用免疫细胞化学染色和Rt-PCR观察诱导后的细胞是否表达视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果:诱导细胞14d后即可见有神经元样细胞出现,实验组MSC的Rhodopsin表达率为35.1%±6.2%,而对照组中无Rhodopsin阳性的细胞,实验组MSC的NSE表达率为33.6%±4.0%,对照组为10.6%±5.0%,实验组MSC的GFAP表达率为9.6%±1.5%,对照组为13.7%±3.0%。RT-PCR鉴定结果分析示实验组MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表达,而对照组的只表达GFAP和NSE,未见Rhodopsin条带。结论:体外培养的rMSC,经过视网膜光感受器细胞培养上清液导,可以分化为视网膜光感受器样细胞。     

当归诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经元样细胞

研究当归体外定向诱导人脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化的作用.自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.AMSCs用25×10-6L/mL〖JP〗当归注射液预诱导24 h后,用100×10-6L/mL当归注射液不含血清的DMEM/F12进行诱导.光镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.人脂肪组织中能够分离培养出生长旺盛的脂肪间充质干细胞,当归诱导24 h后,部分AMSCs转变为神经元样细胞,出现突起,免疫细胞化学染色NSE呈阳性、GFAP阴性.人脂肪间充质干细胞在体外可被当归诱导分化为神经元样细胞 .     

Cyclopamine对牛脂肪间充质干细胞细胞周期相关基因表达的影响

间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力,能在体外诱导成脂细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞等.脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)取材方便,来源较为丰富.本试验利用hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine(CPA)对牛AMSCs的细胞分裂周期机制做了初步探讨.先用血清饥饿法使细胞处于G0/G1期,再经CPA处理,检测不同处理时间的细胞周期蛋白cyclinA、cyclinD和cyclinE的表达情况.经CPA处理的细胞,其周期蛋白cyclin A、cyclin D和cyclin E的表达水平显著低于对照组.表明,CPA通过抑制细胞周期蛋白基因的表达从而抑制了细胞的增殖.     

骨形成发生蛋白对人骨髓间充质干细胞的影响

目的探讨骨形成发生蛋白(BMP)对人骨髓间充质干细胞的影响及调节作用.方法使用含BMP-7基因的PTracer-CMV载体感染人骨髓间充质干细胞(h MSCs),并设未转染组和空载体组,免疫组化法检测BMP-7蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,湿化学法检测碱性磷酸酶合成情况.结果培养48 h后,BMP-7转染组h MSCs增殖速度明显高于未转染组和空载体组,差异具有统计学意义(P0.05);未转染组与空载体组h MSCs增殖速度之间比较差异无统计学意义(P0.05).BMP-7转染组各时间点G_0/G_1期细胞比例均明显低于未转染组和空载体组;S期、G_2/M期的细胞比例均明显高于未转染组和空载体组,上述差异具有统计学意义(P0.05);各时间点未转染组与空载体组G_0/G_1期、S期、G_2/M期细胞比例间差异均无统计学意义(P0.05).BMP-7转染组h MSCs细胞碱性磷酸酶含量明显高于未转染组、空载体组,差异具有统计学意义(P0.05).结论 BMP-7可促进h MSCs体外增殖和向成骨细胞分化,可能与促进细胞由G_1期进入S期、DNA合成增加、提升DNA合成的后期细胞数量有关.     

肝细胞生长因子对人脐带间充质干细胞体外增殖的影响

为了改善无血清培养基促细胞增殖能力,探讨了肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)体外增殖的影响。采用人脐带来源的MSCs,在实验室前期自制的无血清培养基SFM-O中添加不同浓度的HGF,采用CCK-8法测定细胞增殖;使用流式细胞术检测细胞周期,通过Western blot法检测细胞周期蛋白Cyclin D1及相关信号通路蛋白的表达。结果表明：在自制的无血清培养基中添加10 ng/mL的HGF能够有效促进MSCs的增殖;HGF能增强MSCs的整合素表达,进一步通过激活FAKAKT-mTOR信号通路促进Cyclin D1蛋白合成,加速细胞周期从G1期到S期的转变,从而促进MSCs增殖。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为RPE样细胞的探讨

目的:探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外定向分化成视网膜色素上皮(RPE)样细胞所需的微环境。方法:采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离纯化BMSCs,第一阶段将培养第3代的细胞以bFGF、EGF及BDNF三种因子首先进行向神经前体细胞诱导分化,应用免疫细胞化学检测诱导细胞巢蛋白表达情况,当巢蛋白阳性表达率达到最高时去除诱导因子,进行第二阶段与第三代人RPE细胞共培养诱导2w,两阶段诱导后均采用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测角蛋白及RPE65蛋白表达情况。结果:免疫细胞化学检测方面,诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达,第12d阳性表达率达到最高,达(86.9±2.6)%,第一阶段诱导后见角蛋白表达,未见RPE65蛋白表达,第二阶段诱导后见角蛋白表达,阳性率为(60.8±3.1)%,见RPE65蛋白表达,阳性率为(25.7±3.8)%。RT-PCR检测方面,两阶段角蛋白与RPE65蛋白结果与免疫细胞化学检测结果一致。结论:体外采用分阶段诱导法,应用因子bFGF、EGF、BDNF及与RPE细胞共培养的微环境作用下能在体外诱导BMSCs表达RPE细胞标志物角蛋白以及RPE65蛋白。     

光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞为视网膜样细胞的研究

目的:探讨大鼠视网膜片光损伤后诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成视网膜细胞的可能性。方法:实验研究。采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,用大鼠视网膜片光损伤后的上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合成的条件培养液诱导MSC细胞7～8d。用免疫细胞化学染色和RT-PCR观察诱导后的细胞是否表达视紫红质、GFAP、NSE。结果:第3代MSC细胞经诱导后有(36.64±7.84)%表达rhodopsin,(20.21±6.47)%表达GFAP,(21.83±2.98)%表达NSE。RT-PCR鉴定结果分析示GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表达。结论:光损伤SD大鼠视网膜片培养上清液可诱导MSCs分化为视网膜样细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。     

猪脂肪间充质干细胞分离培养及成骨诱导

脂肪间充质干细胞(AMSCs)是一类存在于脂肪组织中具有多向分化潜能的干细胞．近年来的研究证明,脂肪组织具有取材方便和干细胞含量高的优势,在研究与应用领域较骨髓干细胞具有更广阔的应用前景．猪是一种比啮齿类等更接近人类的动物,具有较强的脂肪沉积能力．文中探讨了猪脂肪间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件．采用I型胶原酶消化分离脂肪基质微管成分(SVF),传代培养扩增,流式细胞仪检测细胞表面标记．取第5代AMSCs,以含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠的培养基诱导培养,光学显微镜下观察,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变．分化细胞碱性磷酸酶(AIP)染色呈阳性,RT-PCR检测到I型骨胶原(COL-I)和骨钙素(OCN)表达,结果表明可以从SVF中分离培养出AMSCs,经传代后可提高其纯度．经流式细胞仪检测,其CD105和CD44表达呈阳性,CD14,CD34,S-100,HLA-DR呈阴性,在合适的诱导条件下,可向成骨细胞分化．