MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

小鼠白细胞介素-18的克隆及真核表达质粒的构建

克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）,并与真核表达质粒pcDNA3.1/HisB重组,构建真核表达重组质粒.采用RT-PCR,从小鼠肝细胞中扩增IL-18的全长cDNA.经Hind Ⅲ,EcoR Ⅰ双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pcDNA3.1/HisB.通过酶切、PCR及测序对重组体进行鉴定.经鉴定,重组质粒构建正确,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/mIL-18,为下一步进行IL-18的功能研究奠定了基础.     

HAb18G/CD147真核荧光蛋白的表达及鉴定

构建肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及缺失片段E51（第22—50位氨基酸缺失）的真核荧光蛋白表达载体,进一步研究该基因在肝细胞肝癌发生中的作用。通过PCR及Overlapping PCR的方法获得目的基因．与荧光载体pEGFP—N1双酶切、连接、转化E．coli JM109．构建含有肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及E51的真核荧光蛋白表达载体．并经限制性酶切及序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染COS-7细胞,进行瞬时表达;荧光显微镜观察EGFP表达,通过流式细胞术检测蛋白的表达情况,明胶酶谱法鉴定其功能。成功地构建了真核荧光蛋白表达载体pEGFP—N1／HAb18G、pEGFP—N1/E51,并经限制性酶切及序列分析证明外源基因插入正确;流式细胞术鉴定该蛋白表达正确;功能实验证实缺失片段E51不具有诱导成纤维细胞分泌MMPs的功能．结果显示HAb18G／CD147基因第22—50位氨基酸与其刺激成纤细胞分泌MMP和功能有密切关系。实验结果为HAb18G蛋白分子的生物学功能研究奠定了基础。     

Hirulog 18在大肠杆菌中的表达及其生物学活性检测

以化学合成的Hirulog18基因为模板,经PCR扩增、限制性内切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ消化,将编码Hirulog18的基因片断插入表达载体pET-32b中编码硫氧化还原蛋白（Trx）基因序列的下游.用重组质粒转化感受态大肠杆菌-BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达Trx-Hirulog18融合蛋白.复性、肠激酶酶切、Ni-Sepharose和HPLC纯化后,用质谱测定其分子量并进行活性测定.检测结果表明构建的PET-302b/Hirulog18能够在大肠杆菌中高效表达,表达的Hirulog18具有较低的凝血酶抑制活性并能够竞争抑制Angiomax活性.     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

脉胞菌hH3v基因的初步研究及原核表达载体构建

根据植物表达载体pET52（b）多克隆位点和脉胞菌着丝粒结构相关蛋白CenH3的编码基因hH3v序列，设计引物，通过PCR扩增将基因两端加上KpnⅠ和SacⅠ酶切位点，经双酶切后将hH3v插入表达载体pET52（b）中，利用热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在选择培养基上挑取单菌落培养，经PCR检测，表明目的基N原核表达载体构建成功，为着丝粒结构进一步的研究提供了基础．     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体，为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响，设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中，构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA；建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明，已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

EGFR基因C端结构域真核表达载体的构建

构建EGFR基因C端结构域的真核表达载体.应用PCR技术,从含EGFR基因C端结构域的大肠杆菌DH 5α中扩增其序列,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,经酶切及测序进行验证.PCR扩增片段与预期结果相符,真核表达载体构建成功,测序结果与GenBank公布的基因一致.成功地构建了EGFR基因C端两个结构域的真核表达载体.     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白的克隆及表达

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白（ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ）的克隆和表达,是研究抗冻蛋白抗冻机制的重要步骤之一,有助于揭示抗冻蛋白分子结构与活力的关系．用 Ｐ Ｃ Ｒ 法获得 ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ 基因片段,构建了分泌型表达载体 Ｐｌａｃ Ｉ Ｑｐａｒ８ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ．用 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 法测其表达水平,氨基酸组成分析及质谱分析证明表达的蛋白与天然蛋白完全一致,并具有天然蛋白相同的活力．     

p63在胃癌组织中的表达

目的:探讨抑癌基因p53蛋白家族成员p63蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况.方法:回顾性分析41例胃癌及37例癌旁组织,利用组织微阵列技术,构建88点组织阵列,并采用免疫组织化学技术S-P法检测该阵列中p63蛋白在胃癌及其癌旁组织中表达情况.结果:①p63蛋白定位于细胞核,呈弥漫分布的棕黄色颗粒;②胃癌组织中,p63蛋白表达于核大间变细胞中;p63蛋白在高分化型胃癌中阳性表达率为5.9%,在低分化型胃癌中的阳性表达率为41.7%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);③p63蛋白在胃癌癌旁组织中无表达,在胃癌中的阳性表达率为24.4%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:①p63蛋白的高表达可能参与了胃癌的发生;②p63与胃癌的分化程度有关,并可能参与了胃癌细胞的分化.     

人胃癌组织中FAP-1的表达及意义

为了探讨FAP-1在胃癌中的表达与细胞增殖和凋亡的关系及其临床意义,采用免疫组化SP法检测40例胃癌、20例胃良性肿瘤及10例正常胃粘膜组织中:FAP-1蛋白的表达水平。结果表明FAP-1蛋白的阳性表达主要定位在细胞浆内,少数也可见于核周。FAP-1蛋白在正常胃粘膜组织中呈阴性表达,胃良性肿瘤中的表达率为20%(4/20),胃癌中的阳性表达率70%(28/40),与前两者相比差异有显著性(P<0.01),而对照组与胃良性肿瘤组无显著性差异(P>0.05)。FAP-1的表达与胃癌的病理分化相关,而与年龄、性别、肿块大小、转移性无明显相关性。     

白血病G6PD蛋白表达的研究

目的:观察白血病患者骨髓中白血病细胞葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G6PD)蛋白的表达情况,探讨G6PD与白血病的关系。方法:应用免疫组化方法检测35例白血病患者和35例非恶性血液病患者骨髓组织标本中白血病细胞G6PD蛋白的表达,比较白血病患者和非恶性血液病患者G6PD蛋白表达率的差异。结果:G6PD蛋白在白血病骨髓组织白血病细胞中呈现弱阳性表达。35例白血病患者骨髓组织中G6PD蛋白阳性表达率为25.7%(9/35),而35例非恶性血液病患者骨髓组织中G6PD蛋白阳性表达率为2.9%(1/35),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:白血病可能存在G6PD蛋白的表达上调,值得进一步研究。     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择

以ZG1( )、ZG1(-)、ZG2( )、ZG2(-)、ZG3( )、ZG3(-)寡聚核苷酸片段为材料，合成了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA必需的35个氨基酸的折叠片段，将此片段分别克隆到pET3b质粒和pBLZ质粒中．酶切后用2％琼脂糖电泳检测证明两者克隆成功．将这2种重组质粒分别转化到E.coli DH5a中．发现pET3b重组体在E．coli DH5a中表达成功．而pBLZ质粒重组体在E．coli DH5a中不能成功表达；从转化子中分离得到重组质粒pET3b,酶切和序到分析都证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因．     

人骨形态发生蛋白4多拷贝表达盒的构建及其表达

为了了解在毕赤酵母中人骨形态发生蛋白4基因剂量对其表达量的影响,利用毕赤酵母表达载体pAO815质粒上的2个同尾酶BglⅡ和BamH Ⅰ在体外构建了人骨形态发生蛋白4成熟肤序列1,3,6,9个拷贝表达盒,并对它们进行表达量研究.结果表明,在毕赤酵母中表达人骨形态发生蛋白4蛋白时,1个拷贝基因能达到最大表达量,增加人骨形...     

精氨酸激酶基因的蛋白表达及实时荧光定量分析

为构建棉铃虫精氨酸激酶基因(AK)的原核表达系统及确定2种不同品系的棉铃虫体内AK的表达量差异,以pET-28a质粒为表达载体,将AK基因重组转化至大肠杆菌BL21中进行原核表达。采用SDS-PAGE电泳及实时荧光PCR定量分析。结果表明:经IPTG诱导AK基因在大肠杆菌BL21得到表达,表达的融合蛋白其分子量与预测结果一致;石河子地区田间品系棉铃虫体内AK基因的表达量远远大于敏感品系棉铃虫体内AK基因的表达量为77.36%,表明石河子田间品系棉铃虫的生命代谢活动的能力要强于敏感品系。     

绿色荧光蛋白基因在大黄鱼体内的表达

以绿色荧光蛋白基因为报告基因，以pIRESnco为载体质粒，制备含有报告基因的质粒，以肌肉注射的方式导入大黄鱼体内，每隔一周用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因在鱼体不同部位的表达情况。结果表明，绿色荧光蛋白基因可以大黄鱼体内得到表达，表达时间高达28d以上。绿色荧光蛋白基因不仅可以在肌肉注射部都组织细胞得到表达，而且在其它部位的肌肉、肝脏、肾脏和心脏等组织中也有表达，但表达水平低于肌肉注射部位组织。