vMIP-Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助子高效表达

目的:构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法:用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果:阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论:用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

vMIP-II肽在大肠杆菌中的双辅助子高效表达

目的 :构建病毒趋化因子 (vMIP -II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP -II重组肽 .方法 :用PCR法获得vMIP -II基因片断 ,将其插入表达载体pQE ,构建重组表达载体pEh -vMIP .表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α ,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆 .结果 :阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP -II重组肽 ,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符 (约 8× 10 3)的诱导表达条带 ,其表达量约占菌体总蛋白的 2 0 % .分析表明 ,vMIP -II重组肽主要以可溶性形式表达 .结论 :用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP -II的成功 ,为进一步研究vMIP -II的功能及应用奠定基础 ,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

大肠杆菌高效表达载体pSY621的构建

基因在大肠杆菌中的表达往往受转录起始区的二级结构所影响,通过改变原有载体ｐＳＹ６００的ＴＩＲ区域的序列,来改造出一个能高效表达的载体ｐＳＹ６２１。在表达载体上接入ＡＮＧ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）,ＮＴ４（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４）基因,由ＰＣＧＥＮＥ软件来计算二级结构和自由能,设计修改片段,产生新载体ｐＳＹ６２１。通过表达ＡＮＧ,ＮＴ４,ｐＺＰ３（ｐｉｇ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）基因来检测     

重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达

目的：在巴期德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽，方法：用SacI和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒，电打孔法导入毕赤酵母GS115后，在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子，然后根据甲醇利用快速型（Mut^ ）和甲醇利用缓慢型(Mut^s）菌株的不同生长特点，筛选出Mut^ 和Mut^s型转化子，用PCR法进一步鉴定阳性克隆，分别用甲醇诱导Mut^ 和Mut^s型转化子表达目的蛋白4d，取培养产物冻干浓缩，进行SDS-PAGE和Western blotting，筛选出能特异表达目的的蛋白的菌株，分析蛋白的含量及纯度。结果：重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达，其表达量约占培养上清分泌蛋白的76.5%，结论：重组人巨细胞病毒（HCMV）嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达。     

化学合成的α—降钙素基因相关肽基因在大肠杆菌中的融合表达 …

化学法合成的α－降钙素基因相关肽基因从ｐＸＺ１０１有达质粒转移到ＰＵＣ１８质 测序鉴定后,克隆到ＰＧＥＸ表达载体上,在大肠杆菌Ｃ６００中表达。     

抗菌肽A-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与初步分泌表达

采用 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ和 Ｂａｍ Ｈ Ⅰ接头将化学合成的大小为４５ 对碱基的 Ｃ Ａ（１ － ７） Ｍ（５ － １２） 杂合肽基因克隆到 Ｅ．ｃｏｌｉ 分泌表达载体ｐ Ｉ Ｎ－ Ⅲ· Ｏｍｐ Ａ２ 上的 Ｅｃｏ ＲⅠ－ Ｂａｍ ＨⅠ位点之间,并对其在 Ｌｐｐ启动子和 Ｌａｃ 启动子／ 操纵子调控下的分泌表达进行初步研究重组子的地高辛（ Ｄｉｇ） 核酸探针杂交和酶切分析结果表明杂合肽基因克隆成功;抑菌活性的检测结果表明杂合肽基因表达产物有一定的抑菌活性     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

人疱疹病毒8编码的趋化因子vMIP-Ⅱ在大肠杆菌的优化表达

目的：探讨优化vMIP-Ⅱ/MBP融合蛋白表达载体pMal在原核细胞中的表达条件，并对其表达产物进行纯化。方法：通过接菌，诱导表达，实验了解诱导时不同的温度，诱导时间，IPTG浓度对蛋白表达量的影响，并进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳分析。结果：发现该菌在含0.3mmol/L IPTG的TB培养基中，28℃诱导表达4h，可使诱导蛋白表达达量占菌体蛋白总量的10%。结论：vMIP-Ⅱ/MBP的表达受温度条件影响较大，低温诱导时表达水平较高，从而为该工程菌的中试提供了实验基础。     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

GST—EGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

将小鼠ＥＧＦ基因克隆至谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,转化大肠杆菌ＤＨ５α,获得高效表达,融合蛋白ＧＳＴ－ｍＥＧＦ经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ－ＧＳＨ亲和层析柱纯化和凝血酶消化获得有免疫活性的ｍＥＧＦ,表明ＧＳＴ融合基因表达系统不仅能提高表达产物的稳定性也有利于产物的纯化     

重组人截短型IL—6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型IL-6原核高效表达系统。用PCR方法获得截短的人IL-6基因（rhIL-6cDNA）,将其插入克隆载体pUC18中,经证实后再克隆入表达载体pBV220中,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型IL-6基因的克隆载体,经测序证实完全正确;构建了截短型IL-6的原核表达质粒pBV220/rhIL-6并获得高效表达;初步纯化的表达蛋白的比活性为5×10     

抗菌肽A—蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克？…

采用Ｅｃｏ ＲⅠ和ＢａｍＨ Ⅰ接头将化学合成的大小为５对碱基的ＣＡ（１－７）Ｍ（５－１２）杂合肽基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ分泌表达载体ｐＩＮ－Ⅲ．ＯｍｐＡ２上的ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ位点之间，并对其在Ｌｐｐ启动子和Ｌａｃ启动子／操纵调控下的分泌表达进行初步研究。     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体，PCR合成ompT引导序列，插入该载体多克隆位点上游，构建了分泌型原核表达载体pTO-OT．将2个外源基因克隆至pTO-OT，2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达．表达产量在25％～34％之间．Western blot分析证实了融合蛋白可被大肠杆菌信号肽酶有效地切割。并具有良好的免疫学活性．对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的表达稳定性，显示了其在基因工程中的应用价值．     

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达

酵母转录因子GCN4是通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质之一，当GCN4二聚体与DNA结合时，亮氨酸拉链区的2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构，而其基区由无规线团结构变为α螺旋．为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理，设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需氨基酸的折叠片段，并将其克隆到Escherichia coli BL21，讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件．在蛋白质的小量表达试验中，重组子Escherichia coli BL21于5mL含有50μg／mL氨节青霉素和34μg／mL氯霉素的LB液体培养基中培养至对数期，加入不同浓度的IPTG，继续培养以诱导蛋白质的表达，在不同的时间(如：诱导前，诱导2，4，6，8h)取样100μL到1．5mL离心管中、离心收集沉淀，将沉淀悬浮于样品缓冲液中，用10％SDS-PAGE检测；在10L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中进行了大量表达，根据小量表达的试验结果确定了IPTG的浓度和诱导时间．结果表明：含有这种拉链蛋白质的重组子Escherichia coli BL21在37℃下小量培养时，0．1-0．8mmol的IPTG均可在2-10h内诱导该蛋白质表达；而大量培养时，0．2mmol和0．4mmol的IPTG在37℃均不可能诱导表达，只在28℃时才表达；小量培养和大量培养的最佳诱导时间为4-6h，诱导剂IPTG的浓度为0．2mmol，大量表达的温度为28℃而不是37℃．     

IGF-Ⅱ在原核生物中的表达

胰岛素生长因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在机体的许多组织中都有表达,具有促进细胞生长和分裂等的多种生物学功能。在本研究中,我们采用RT-PCR法克隆和扩增到了IGF-Ⅱ基因,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到了pET21b-IGF-Ⅱ重组质粒载体,然后将其转化DH5α中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经纯化,并用Western blot检测,显示重组质粒pET21b-IGF-Ⅱ编码一个约25kD的外源蛋白。     

谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质

在成功构建了谷脱甘肽（ＧＳＨ）合成酶基因表达质料（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）的基础上,对不同大肠杆蓖突主菌进行了比较,筛选出高效、稳定表达ＧＳＨ合成酶的工程菌并进行了最佳酶表达条件的研究。结果表明：重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）表达量最高,质粒稳定性好;以５％接各量于３７℃、ｐＨ７．２培养至ＯＤ５５０＝０．５左右,加入诱导剂ＩＰＴＧ（０．ｍｍｏｌ／Ｌ）,同时切换培养条件为３４℃、ｐＨ６     

重组拖丝蛋白基因在大肠杆菌中表达条件的优化

对巳构建的重组蜘蛛拖丝蛋白基因表达菌株pNS2，以IPTG为诱导剂，建立最适表达条件．在LB培养基中添加质量分数为0．1％的甘氨酸和丙氨酸，菌体培养至密度A600＝0.5—0．7时加入浓度为0．2mmol/L的IPTG，诱导5h，可得到表达量占可溶性总蛋白质27．2％的较好结果．     

东亚钳蝎抗神经兴奋肽在大肠杆菌中的表达

自从 1 96 4年以来Ｍｉｒａｎｄａ等人[1] 报道Ａｎｄｒｏｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ和Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕ中的神经毒素 ,蝎毒中一些神经毒素尤其是哺乳动物毒素和昆虫毒素已被广泛研究 .从新鲜蝎毒中制备和纯化天然神经毒素困难重重 ,1 988年Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ等人[2 ] 首次由Ｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ蝎中昆虫神经毒素氨基酸序列推导并化学合成其基因序列 ,且在杆状病毒载体中得到表达 ,自此人们广泛试验将各种属的系列蝎毒素基因重组到大肠杆菌、酵母、杆状病毒、植物等表达载体进行表达 .在中国 ,蝎子及其组织或抽提物被…     

GST—hBTLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBTLyS（human Blymphocte stimulator）基因序列设计合成特异性引物。用RT－PCR从人外周血淋巴细胞扩增出858bp的hBLyS基因，并将其插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/hBLyS.把此重组质粒转化大肠杆菌BL21，经用IPTG诱导，表达出GST－hBLyS融合蛋白。