微量元素对转植酸酶基因小球藻生长的影响

研究了锌、钼、钴、铜、锰、铁6种微量元素对转植酸酶基因小球藻生长的影响.通过单因子实验确定了此6种微量元素促进转基因小球藻生长及胞内植酸酶表达的浓度范围,通过正交实验确定了锌、钼、钴、铜、锰促进转植酸酶基因小球藻生长的最佳浓度,获转植酸酶基因小球藻最大生物量产量的浓度依次为0.10、0.015、0.01、0.015、0.8μmol/L;获转植酸酶基因小球藻最高植酸酶比活值的浓度依次为0.10、0、0.04、0.015、0.4μmol/L.利用微量元素优化配方培养转植酸酶基因小球藻,可使胞内植酸酶比活值显著提高,但微藻生物量产量有所下降.     

植酸酶基因在毕赤酶母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉As3.324的植酸酶基因phyA I，测序分析表明，phyA I全长1515bp,其中111个核苷酸为内含子序列，共编码467个氨基酸，N墙的19个氨基酸为信号肽，序列中存在10个潜在的N-糖基化位点，构建phyA I的酶母转化载体pPIC9K/phyA Ⅱ，电击法转化毕赤酶母GS115，获得植物酶基因重组酶母菌GS115/phyA Ⅱ，其发酵酶活性比As3.324提高了33倍，GS115/phyA Ⅱ植酸酶作用pH有两个峰值，分别为2.5和4.5，最适作用温度为60℃，与As3.324相比，重组毕赤酶母GS115/phyA Ⅱ植酸酶的热稳定性有显著提高。     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析

参考Hartingsvedt已发表的NRRL3135植酸酶（phyA）基因序列,设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以土曲霉CCTCCAF93044总DNA为模板,扩增出了不包括假定的信号肽序列的phyA基因,并将其克隆到PMD18－T载体上,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列,该基因全长为1433bp,与已发表的NRRL3135的phyA基因的同源性为97％,编码一个含458个氨基物的蛋白质。     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

水葫芦提取植物蛋白废液培养小球藻初步研究

为提高小球藻培养的经济效益和高效资源化综合利用水葫芦,初步研究了水葫芦提取植物蛋白废液对小球藻生长、叶绿素和蛋白质含量的影响。研究结果表明,光照条件下,培养藻液中添加不超过6%体积的水葫芦废液,小球藻的生长速度及藻体叶绿素和蛋白质含量均随废液添加量的增加而提高,即使培养藻液中不添加任何营养元素而只添加1%～6%体积的废液,小球藻的生长速度及藻体叶绿素和蛋白质含量即可达到和超过基础营养液培养组的小球藻,说明水葫芦提取植物蛋白的废液可极大地提高小球藻培养的经济效益,甚至可完全替代营养盐的添加;但在无光条件下,添加废液对小球藻生长无效,说明未经处理的水葫芦废液尚不能作为小球藻异养培养的营养源。     

超声辐射对海水小球藻的生物效应

设计了一个超声频率、超声功率和辐射时间三因素四水平的正交实验,研究超声辐射对海水小球藻的生物效应.实验结果表明,在适宜超声频率条件下,采用低功率、短时间超声辐照可以提高海水小球藻生长速率和脂肪酸不饱和度及主要不饱和脂肪酸的百分含量.方差分析表明,在正交实验所确定的最佳超声条件下,其生长速率常数k×100(h     

镉胁迫对转PprI基因油菜生理生化的影响

利用露天盆栽试验研究了不同浓度Cd胁迫下转PprI基因油菜和非转基因野生型油菜对Cd的吸收特性以及生理响应。结果表明：随着Cd胁迫浓度的升高,转基因和非转基因野生型油菜对Cd的吸收均显著增加,且二者地下部分的吸收都大于地上部分;在0.5 mg/kg Cd处理下,转基因和非转基因油菜对Cd的吸收差异不显著,但1和2 mg/kg处理下转基因油菜对Cd的吸收显著低于非转基因野生型油菜。两种油菜对Cd的富集系数和转运系数均随处理浓度的升高而降低;随着Cd浓度的增加,超氧化物歧化酶（SOD）活性呈现先上升后下降的趋势,且在相同处理浓度下,转基因油菜的SOD活性均高于非转基因野生型油菜;丙二醛（MDA）含量呈上升趋势,且其在转基因油菜中的含量均低于非转基因野生型油菜;叶绿素a和叶绿素b的含量随Cd浓度的升高而下降。因此PprI基因的导入,显著降低了油菜对Cd的吸收,提高了其可食部分安全性。     

MPB和MTB对海水小球藻的抑制作用

研究了哌嗪甲萘醌亚硫酸盐(MPB)和三氨基三嗪甲萘醌亚硫酸盐(MTB)对海水小球藻的抑制作用以及对发光细菌毒性试验分析.结果表明:MPB和MTB对小球藻具有良好的抑制效果而且对环境友好.MPB和MTB在72 h时的半效应质量浓度(EC50)分别为4.28 mg.L-1和6.61 mg.L-1.MPB和MTB对海水小球藻的抑制随着质量浓度和作用时间增加而加强,当达到一定的质量浓度时,MPB和MTB的抑制效果达到饱和.10 mg.L-1以下的MPB和MTB的发光细菌抑光率远远低于30.     

自养小球藻培养条件的优化

在无菌条件下,对影响自养小球藻生长的主要因素进行优化.实验表明,优化结果对小球藻的生长有显著影响.通过正交试验和单因素实验得到了以BG-11培养基为基础的优化培养条件:Na2CO3质量浓度为0.02 g/L、初始pH值为7、N/P为30、接种量为5%、温度25℃、光照强度8 800 lx.该优化条件有效地提高了自养小球藻的生长速率.     

丙型肝炎病毒E2基因在转基因番茄植株中的表达

以T-E1E2为模板扩增得到丙型肝炎病毒包膜蛋白基因E2,构建该基因的植物表达载体p35s-E2．通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄子叶．转基因番茄植株叶片总DNA的PCR、Southern blot检测结果表明,E2基因已整合进了转基因番茄植株基因组中;RT-PCR,Western blot分析证实E2基因在转基因番茄植株叶片中表达．     

溴氰菊酯对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性效应

采用人工光照培养箱室内培养方法,研究了农药溴氰菊酯对一种淡水绿藻--蛋白核小球藻的毒性作用.研究结果表明:溴氰菊酯对蛋白核小球藻96 h的EC50为0.843 mg/L.当溴氰菊酯浓度≥0.8 mg/L时,蛋白核小球藻的生长受到明显抑制,生长滞期延长,光合作用受阻,MDA含量显著提高,细胞膜透性增加.低浓度溴氰菊酯对蛋白核小球藻的生长有一定的促进作用,高浓度的溴氰菊酯处理的小球藻呈现出先抑制其生长而后又促进其生长的趋势.     

农杆菌介导外源基因进入油菜的研究

用甘蓝型油菜子叶为外植体，以农杆菌共培养法将苏云金杆菌δ－内毒素基因和ＮＰＴＩ基因导入油菜．所用的农杆菌为ＬＢＡ４４０４－δ（ｄｉｓａｒｍｅｄｐＡＬ４４０４，ｐＧＡ６４３－δ）．ＰＧＡ６４３－δ为表达载体，其中克隆有ＮＰＴＩ基因和δ－内毒素基因．共培养４ｄ后，转化的子叶被转入含有卡那霉素（Ｋｍ）的分化培养基［１］上，分化出芽．被切下的芽在含有Ｋｍ的生根培养基［２］上生根，移栽后成活的小抗Ｋｍ油菜苗生长良好．用ＤＮＡ分子杂交、ＥＬＩＳＡ分析和生物测定等方法证明外源基因被转移到油菜中．     

转基因小球藻生长动力学、藻粉和油脂产量的研究

对3株导入外源基因的转基因小球藻(Chlorella ellipsoidea SD-0702,C.ellipsoidea SD-0705,C.ellipsoidea SD-0706)进行生长动力学、藻粉产量和产油脂能力的研究,并且与野生型小球藻(C.ellipsoidea SD-0701)进行比较.结果表明:(1)SD-0705的比生长速率最大,代时最短,与SD-0706的比生长速率均高于SD-0701,SD-0702则低于SD-0701;(2)SD-0705和SD-0706的藻粉得率均高于SD-0701,SD-0702则较野生型小球藻低;(3)SD-0705的油脂产量最高,为0.470 g/L,高于SD-0701,其他2株转基因小球藻的油脂产量均低于野生型小球藻.由此筛选出SD-0705作为藻粉和油脂的高产藻株.     

小球藻基因工程选择标记研究

研究了小球藻对10种常见抗生素:庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素、链霉素、G418、潮霉素、Zeocin和氯霉素的敏感性,发现小球藻对庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素不敏感;对G418和潮霉素较敏感;对Zeocin和氯霉素最敏感.利用统计学的方法和原理,确定了G418、潮霉素、Zeocin和氯霉素在海水培养基和淡化10倍的培养基中对小球藻的半致死剂量和95%可信限.为筛选出小球藻基因工程藻株的选择试剂,建立其遗传转化系统奠定了基础.