腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对大鼠心肌缺血的基因治疗

为研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子对心肌缺血基因治疗的可行性，首先用RT—PCR方法从人胎盘cDNA文库中克隆人肝细胞生长因子(HGF)基因全长编码区cDNA，通过脂质体共转染和细胞内质粒同源重组的方法构建了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad—HGF．经过在293细胞系内的扩增和氯化铯密度梯度离心获得大量纯化的重组腺病毒、体外实验中用ELISA方法证明肝细胞生长因子能在原代培养的乳大鼠心肌细胞中表达并分泌到培养上清液中、然后用MTT方法测定了其对内皮细胞的刺激增殖作用、活体实验中用绿色荧光蛋白基因作为报告基因检测了腺病毒在大鼠体内的分布和表达持续时间，通过大鼠冠状动脉结扎后制作的心肌缺血动物模型，证明重组腺病毒Ad—HGF对大鼠，心肌缺血的治疗是有效的。以上结果说明Ad—HGF的构建是成功的，在体内外都显示了其生物学活性、为基因治疗缺血性心脏病提供了实验依据．     

人肝细胞生长因子基因治疗犬肢体动脉闭塞病

以犬急性后肢完全缺血为模型, 观察携带人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因的质粒(pUDKH)的治疗效果. 在完全结扎一侧股动脉及其分支后, 立即将不同剂量的裸露质粒 pUDKH一次性多点直接注射至结扎部位附近的局部肌肉内, 30 d时血管造影可见各剂量治疗组均有丰富的新生血管和侧枝循环的形成, 90 d时更为明显, 从而恢复了下肢远端血液供应; 而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管. 另外, 各组在转移pUDKH后90 d时股动脉血流量均已恢复到结扎前的水 平, 而转移空质粒的各组股动脉血流量恢复较慢, 仅为结扎前的1/5 ~ 1/3. 股动脉脉搏幅度测定结果也表明, 转移pUDKH的各组在90 d时脉搏幅度均得到恢复, 而对照组犬多数几乎测不到脉搏. 经比格犬长期毒性和大鼠急性毒性实验, 血液生化及病理检查未发现有转基因诱发的不良作用. 从而认为局部肌肉注射质粒pUDKH可促进犬完全缺血肢体血管的重建, 对肢体动脉闭塞病有潜在的临床治疗作用.     

腺病毒介导的CTLA4-FasL基因转移预防小鼠自身免疫性糖尿病

抑制或删除自身免疫性T细胞对胰岛素生成细胞——β细胞的破坏可以有效预防1型糖尿病的发生. 研究表明CTLA4-FasL双功能免疫抑制分子可以抑制T细胞活化及促进T细胞的凋亡. 在多次小剂量(40 mg/kg)腹腔注射链脲佐菌素诱导的小鼠自身免疫性糖尿病模型中, 初次给予链脲佐菌素的同时, 经尾静脉输注(2 ~ 5)×10⁸ pfu/mL CTLA4-FasL腺病毒进行基因治疗后, 糖尿病的发病率显著降低(13%, n = 15), 血糖和胰岛素水平维持正常; 且显著诱导胰腺淋巴细胞凋亡及胰腺淋巴细胞IFN-γ与Vβ8.2 TCR的mRNA表达明显下降. 表明腺病毒介导CTLA4-FasL基因治疗, 有效诱导自身反应性T细胞凋亡, 提示其在预防自身免疫性糖尿病的潜在价值.     

携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因（ｈⅨＲ３３８Ａ）及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的ｒＡＡＶ/ＨＳＶ杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 １．２５ × １０１２病毒颗粒／ｍＬ,然后,利用这一重组病毒,对ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ进行离体及在体表达, 获得了 ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ在肌细胞系 Ｃ２Ｃ１２及血友病 Ｂ小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达（２５５１．３２± ９２．１４）ｎｇ·（１０６细胞）－１·（２４ｈ）－１及４６３．２８ｎｇ·ｍＬ－１,与野生型Ⅸ因子的表达水平（２５６５．７６±６４．３６）ｎｇ· （１０６细胞）－１·（２４ ｈ）－１及４５３．９２ ｎｇ· ｍＬ－１无显著性差异．然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 ２．４６倍.．将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 Ｂ基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──ｒＡＡＶ／ＨＳＶ杂合病毒包装系统──在重组ＡＡＶ载体大量制备中的应用     

表达血管内皮生长因子受体2胞外全长片段的重组鼠沙门氏菌对小鼠肿瘤的预防作用

研究目的基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的稳定表达及以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的口服基因疫苗体内代谢情况, 并探讨重组疫苗菌防治小鼠肿瘤的可行性. 将真核表达载体pcDNA3.1+/VEGFR2_(n1-7)导入鼠减毒伤寒沙门氏菌SL3261中构建口服重组疫苗菌疫苗SL3261-pcDNA3.1+/VEGFR2_(n1-7). 通过PCR扩增检测真核表达载体中真核启动子CMV; 通过透射电子显微镜下检测重组疫苗菌形态和鞭毛结构, 观察连续传代后重组疫苗菌内目的基因能够稳定表达且不影响重组疫苗菌的生长特性. 重组疫苗菌经由灌胃对小鼠进行基因免疫后, 透射电子显微镜下在小鼠的肝、脾、小肠、大肠组织中可检测到减毒沙门氏菌的分布. 2周后用CT-26小鼠结肠腺癌细胞进行攻击, 疫苗组小鼠肿瘤生长明显受抑制, 且生存期远远超过对照组小鼠(P<0.05), 免疫组化显示免疫组小鼠肿瘤组织内CD4⁺及CD8⁺ T细胞浸润. 肿瘤组织超微结构显示疫苗组小鼠肿瘤细胞分化较两对照组为好. 本研究证实外源性目的基因能够在鼠减毒沙门氏菌中长期稳定表达, 且不影响沙门氏菌的生长特性; 并且该重组疫苗菌可将具有治疗性目的基因带入机体并产生抗瘤效应而本身对机体无明显的毒性效应, 为减毒沙门氏菌作为口服基因疫苗的载体及其在体内的分布代谢提供了理论依据, 为肿瘤的预防和治疗提供一条简便、安全、有效的途径.