重组PAI—2基因在NIH3T3细胞中的活性表达

构建了人ＰＡＩ—２ｃＤＮＡ睥达质粒，以ＮＩＨ３Ｔ３为转染宿主细胞，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和ＰＡＩ活性扩散试验结果表明人ＰＡＩ—２ｃＤＮＡ可以在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中正确表达出ＰＡＩ—２蛋白，且具有抑制ＰＡ的活性，同时未能检测到ＮＩＨ３Ｔ３细胞表达ＰＡＩ—２蛋白质．为探讨ＰＡ—ＰＡＩ—２系统的调控机制打下基础．     

NIH3T3细胞与其癌变细胞的PARP酶被抑制后DNA损伤修复的 …

ＰＡＲＰ酶（聚ＡＤＰ核糖基聚合酶Ｐｏｌｙ－ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＰＡＲＰ）对于ＤＮＡ损伤修复具有重要功能，正常细胞及其癌变细胞的该酶对抑制剂的敏感程度可能会有差异。为此，通过姐妹染色体交换频率，带报告基因的质粒转化频率，以及彗星测定等方法，对ＤＮＡ的损伤修复进行初步的检测。实验结果表明，正常细胞和癌变细胞ＰＡＲＰ酶在抑制剂作用下酶活性都会降低，但是癌变细胞的ＰＡＲＰ酶对抑制剂     

PI3K等5条信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调节作用研究

为从基因转录水平解析信号通路对NIH3T3细胞周期进程的调控作用,用小鼠基因表达谱芯片Mouse Genome 4 302.0检测信号通路相关基因表达丰度发现,PI3K,STAT3,钙蛋白酶,Rho家族鸟苷酸激酶和VEGF等5条信号通路的105个基因在该细胞的细胞周期中发生有意义的表达变化.分析基因表达变化预示的信号通路作用表明,上述5条信号通路依次促进G1期、G1/S转换期、S期、G2/M转换期和M期进程.结论:上述5条信号通路促进NIH3T3细胞的细胞周期进程.     

hTERT基因电转染人γδT细胞建立可诱导的永生化细胞系

利用电击将外源基因hTERT与pTet-on调控质粒共转染人γδT细胞,建立可诱导的永生化人γδT细胞系.分离人PBMC,体外刺激增殖后经磁珠分选纯化,然后对其进行外源hTERT基因和pTet-on调控质粒的共同电转染,并加入强力霉素诱导目的基因表达.电转染程序T 23和T-20的效率分别为37.5％±0.9860％和30.5％±0.5590％.经鉴定,外源hTERT基因能够整合人γδT细胞基因组中并在诱导后表达.程序T-23的转染效率更高,强力霉素的有效诱导浓度是600ng/mL,志愿者本人的血清更利于电转后细胞的存活.     

人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达

为探讨转人血管内皮抑制基因（endostatin）在转染细胞中的表达，利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒，通过脂质体（lipofectamine）将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液。用重组病毒液感染NIH3T3细胞，经G418筛选获得转入endostatin基因细胞株NIH3T3-endo。同法制备对照细胞株NIH3T3-pLncx.PCR检测NIH3T3-endo细胞基因组，在扩增产物中一份550bp人endostatin基因特异性片段，对照组为阴性。免疫组化测定示仅NIH3T3-endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达，说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞，并获得稳定表达。     

PDIA3对人Jurkat T细胞TCR信号通路的调控

为了研究蛋白质二硫键异构酶A3前体(protein disulfide isomerase A3 precursor, PDIA3)在T细胞受体(T cell receptor, TCR)信号通路中的具体功能,利用电穿孔法将T 细胞内的PDIA3蛋白水平敲低,通过Western blotting检测ζ-链相关蛋白70(zeta-chain associated protein 70, ZAP70)的磷酸化修饰水平, 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)实验检测细胞因子IL-2的分泌情况,流式细胞术分析分化抗原簇69(cluster of differentiation 69, CD69)表达水平及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路.结果显示:T细胞中PDIA3蛋白下调后导致ZAP70蛋白的磷酸化水平、CD69表达和IL-2的分泌都明显降低,并且影响了NF-κB信号通路,表明PDIA3蛋白对T细胞的活化有促进作用,参与T细胞TCR信号通路的调控,为进一步深入研究PDIA3与TCR下游一些功能蛋白的相互作用打下了基础.     

两株NIH-3T3细胞间的基因表达差异研究

通过与细胞膜表面的受体TNFRI结合．肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可诱导凋亡或坏死．有两株NIH-3T3细胞在TNF刺激下分别存在两种死亡情况：NIH-3T3(R)为caspase依赖的凋亡；而NIH-3T3(S)的死亡则不依赖caspase．为了深入研究两株细胞在TNF-α诱导下选择不同死亡方式的机理，本研究利用cDNA表达谱芯片对这两株细胞的基因表达差异性进行研究，筛选出差异表达的基因，利用逆转录PCR验证，从而鉴定出两个可能与细胞死亡相关的基因：calpain6和RIP3．     

FOXP3+调节性T细胞与免疫细胞治疗

 CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞（Treg）负责维持机体免疫稳态、调节免疫耐受。Treg细胞通过调控机体对外来或自身抗原的免疫应答水平,在抗自身免疫及抗肿瘤免疫中均发挥重要作用。深入分析了Treg细胞功能的分子机理,通过FOXP3⁺Treg细胞体外扩增或对其进行修饰改造,可以使其在不同组织及炎症微环境下特异性促进对机体的有益作用,减少副作用,这一现象会为免疫细胞治疗提供新思路与新策略。     

人参皂甙Rg1对3T3细胞增殖作用的研究

利用MTT比色分析法和Brdu增殖细胞标记法,检测不同浓度GRg1对3T3细胞增殖的影响.发现GRg1在适当浓度范围内可以促进3T3细胞的增殖,为进一步探讨GRg1的药理作用及对胚胎发育的作用机理提供一些研究基础.     

FOXP3蛋白复合体及调节性T细胞功能研究进展

 FOXP3⁺CD4⁺CD25⁺调节性T 细胞（FOXP3⁺Tregs）负责正常机体免疫稳态的维持。人类许多重大免疫性疾病均与调节性T 细胞的功能异常相关。叉头状家族转录蛋白FOXP3 是调节性T 细胞中特异性表达的关键转录因子,对调节性T 细胞的发育与功能有着重要作用。近年来的研究表明,FOXP3 蛋白转录调控复合体的装配及其翻译后修饰调节对调节性T 细胞的功能至关重要,相关生理过程受到各种炎症微环境的动态调节。深入研究FOXP3⁺Tregs 活性调节的分子机制将为攻克人类重大免疫及相关性疾病提供创新性线索。     

慢性热应激对猪肠道CD3^＋T细胞表达的影响

以猪肠道CD3＋T细胞为研究对象,旨在观察慢性热应激对猪肠道黏膜免疫功能的影响。12头小型猪随机平均分成热应激组和常温对照组两组。人工气候室内,热应激组模拟夏季炎热气候,气温从26～39℃24h循环变温,在39℃时维持4h;常温对照组在24℃下饲养。试验持续10d,热应激10d后39℃高温持续期结束剖杀试验猪,取其十二指肠中段、空肠及回肠中段进行固定、石蜡切片、免疫组织化学染色,观察十二指肠、空肠及回肠中CD3＋T细胞数量的变化。结果显示：实验猪十二指肠黏膜上皮层、固有层及十二指肠肠腺均呈CD3强阳性,与对照组相比,CD3阳性面积系数显著上升（P〈0.05）;空肠和回肠黏膜上皮层的CD3阳性细胞数量也显著增加（P〈0.05）,而固有层中的CD3阳性细胞数量则无明显变化,增加的幅度小于十二指肠。慢性热应激中实验猪肠道结构严重受损,消化吸收功能严重下降,而肠道CD3＋T细胞的增多,可能是机体肠道黏膜免疫功能的一种代偿性增强反应。     

Ce(NO3)3对不同细胞DNA的损伤作用研究

以体外培养３Ｔ３ 细胞和ｌｏｖｏ 细胞为研究对象, 运用单细胞凝胶电泳技术, 探讨了Ｃｅ（ＮＯ３）３ 对这２ 种细胞ＤＮＡ 的损伤作用．结果表明Ｃｅ（ＮＯ３）３ 对２ 种细胞均有损伤作用： 低浓度（１ ｍｍｏｌ／Ｌ） 时,ｌｏｖｏ 细胞的ＤＮＡ 损伤率要明显高于３Ｔ３ 细胞ＤＮＡ 的损伤率, 高浓度（５ｍｍｏｌ／Ｌ） 时, 则２ 种细胞的损伤率几近相同, 提示较低浓度Ｃｅ （ＮＯ３） 对正常细胞和癌细胞存在着不同的作用, 稀土对癌细胞具有选择性杀伤作用; Ｃｅ （ＮＯ３） 具有一定的遗传毒性     

木犀草素对3T3-L1细胞成脂分化不同阶段的影响

为了研究木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中各个阶段的作用,文章探讨相关的分子机制,在细胞分化的不同阶段添加20μmol/L木犀草素处理,通过油红O染色和定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测其对3T3-L1前脂肪细胞脂肪化过程的细节作用。3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程共需8 d,结果表明,木犀草素从细胞分化开始处理8 d可以显著降低其脂滴生成及脂肪化相关基因PPARγ、C/EBPα、Ap2和Fas等的表达,处理2、4、6 d对脂滴生成抑制效果不明显,但可以显著抑制脂肪化相关因子表达,说明木犀草素在3T3-L1细胞的前期分化和后期成熟过程都发挥了重要作用。     

MTT法检测Rh—bFGF提高Balb／c 3T3细胞酶活性及？…

以Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３细胞为勒细胞，采用体外细胞培养方法，观察重组人碱性成纤维细胞生长因子的促分裂和提高酶活性作用。结果发现：重组人碱性成纤维细胞生长因子提高Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３细胞酶活性的最佳作用浓度为６．２５ｎｇ／ｍＬ，而促分裂增殖的最佳作用浓度为１００ｎｇ／ｍＬ，两者分别与应的对照组比较Ｐ〈０．０１，具有统计学意义。从而证实了重组人碱性成纤维细胞生长因子具有促分裂和增强酶活性的作用。     

脱脂棉替代尼龙毛分离T细胞用于免疫学实验教学的探讨

探讨脱脂棉和尼龙毛分离纯化外周血T淋巴细胞的方法和特点,建立脱脂棉分离T细胞的方法.采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,分别以脱脂棉和尼龙毛分离出T细胞,使用流式细胞仪鉴定细胞纯度和回收率,台盼蓝检测细胞活力.脱脂棉分离T细胞的纯度、回收率和存活率虽然都略低于尼龙毛分离法,但两者比较均无显著性差异(p＞0.05).结果显示脱脂棉分离T细胞是一种简易、快速、经济、纯度较高和基本上不损伤细胞活性的方法,除了可以代替尼龙毛用于免疫学实验教学中,也可作为开放实验培养学生的创新能力.     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

稀土Yb对NIH3T3细胞生长的影响

应用MIT方法,研究了稀土元素Yb对小鼠成纤维细胞生长的影响.以体外传代培养的细胞株NIH3T3为研究对象,给予Yb3+(0.001 mmoL/L、0.01 mmol/L、0.1和1.00 mmol/L)培养1d后,观察NIH3T3细胞的生长情况,同时,应用MTT法检测稀土元素Yb对NIH3T3细胞生长的作用.结果发现稀土Yb对NIH3T3细胞的生长具有明显的抑制作用(P<0.05),且随着Yb3+剂量的增加,对该细胞生长的抑制作用明显增强(P<0.05).这些结果提示稀土Yb具有体外抗纤维化的作用,有望应用于组织纤维化疾病的治疗上.     

胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中脂联素mRNA表达的研究

目的:通过本实验研究脂联素mRNA在胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞中的表达.方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化为脂肪细胞,采用地塞米松诱导建立3T3-LI脂肪细胞胰岛素抵抗模型,运用RT-PCR技术检测脂联素mRNA的表达.结果:随着胰岛素抵抗的发生,脂联素mRNA的表达量明显降低,经过罗格列酮干预胰岛素抵抗后,干预组脂联素mRNA表达量较空白组升高了约103.5%.结论:脂联素mRNA表达量与胰岛素抵抗的发生关系密切,其有望作为治疗胰岛素抵抗的靶基因.     

Spindlin 1编码的蛋白质定位于细胞核并使NIH3T3细胞发生恶性转化

研究了卵巢癌中高表达的新基因spindlin1的亚细胞定位及其对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响, 并探讨了人spindlin1基因的生物学功能. 采用脂质体转染法将构建的融合蛋白表达载体pEGFP-N1/ pEGFP-N1-spindlin1瞬时转染COS-7细胞,观察spindlin1基因的亚细胞定位;同时稳定转染NIH3T3细胞,经G418抗性筛选后,用RT-PCR筛选并鉴定表达spindlin1的稳定细胞株;通过细胞增殖活性、流式细胞检测、软琼脂克隆形成、迁移实验及裸鼠成瘤等对转染细胞的生物学行为进行检测. 结果表明,spindlin1定位于胞核;并促进NIH3T3细胞的增殖,使其处于G2/M期的细胞比例显著增加;同时证实过表达spindlin1的NIH3T3细胞不仅具明显的克隆形成及迁移能力,而且能使裸鼠成瘤. 由此我们得出结论:spindlin1基因过表达可促使NIH3T3细胞发生恶性转化,提示spindlin1可能是一种与肿瘤形成相关的原癌基因.     

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

目的探讨CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞在口腔鳞状细胞癌中的表达情况.方法应用免疫组化SP法检测42例原发口腔鳞状细胞癌患者的癌组织和20例口腔良性肿瘤患者正常黏膜上皮组织中Foxp3的表达,采用χ2检验进行统计学分析.结果 Foxp3阳性的CD4~+CD25~+调节性T细胞在口腔鳞状细胞癌中的表达显著高于正常口腔黏膜组织,差异具有显著统计学意义(P0.01).Foxp3蛋白表达与肿瘤分化程度相关,在高、中分化组为63.64%,低分化组为100%,差异具有统计学意义(P0.05).且其阳性率与肿瘤TNM分期相关,Foxp3蛋白表达在Ⅲ~+Ⅳ期阳性率为88.24%,在Ⅰ~+Ⅱ期表达的阳性率为60%(P0.05).Foxp3蛋白表达与患者年龄、性别、淋巴结转移未见明显相关性(P0.05).结论 CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞在口腔鳞状细胞癌中的大量浸润与肿瘤的发生、发展、浸润、转移密切相关,可能是导致口腔鳞状细胞癌患者不能进行有效抗肿瘤免疫的重要原因之一.