端粒酶催化亚单位hTRT基因在人肝癌组织中的表达

目的：探讨人端粒酶催化亚单位hTRT基因在肝癌组织中的表迭情况．方法：用兔抗人端粒酶催化亚单位多克隆抗体作为一抗，生物素化羊抗兔IgG作为二抗，对肝癌组织石蜡切片采用免疫组织化学方法测定hTRT基因的表达．结果：30例肝癌组织中25例检出hTRT阳性(25／30)，正常肝组织无l例阳性．结论：免疫组织化学法检测hTRT敏感性高、特异性强、重复性好，较其他方法简便、快速、经济且无放射性核素污染等缺点，临床具有推广价值．     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7活性的作用及影响

目的 探讨端粒酶特异性核酶对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性、增殖和凋亡的影响.方法 设计合成RZ基因,构建人端粒酶锤头状核酶真核表达质粒pcDNA3.1( )-hTERT-RZ,测序鉴定.提取MCF-7细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因的cDNA片段,插入载体pMD18-T并测序鉴定.将核酶重组体及hTERT载体体外转录,琼脂糖凝胶电泳检测Rz的切割活性.核酶载体转染乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR法检测核酶重组子转染效率及核酶转染细胞中hTERT mRNA的表达量,TRAP法测定细胞端粒酶活性,MTT法、流式细胞仪测定细胞增殖及凋亡.结果 测序表明peDNA3.1( )-hTERT-Rz和pMD18-T-hTERT构建成功.5%琼脂糖凝胶电泳表明体外转录出Rz和靶基因hTERT,Rz对靶基因hTERT具有切割活性.构建好的核酶真核表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞.发现其潜伏期延长,对数生长期减缓,S期细胞比例降低,G1期细胞比例增高(P＜0.01).端粒酶活性检测发现端粒酶活性明显降低.结论 端粒酶催化亚单位特异性核酶对靶基因hTERT在体外和体内均有催化切割活性,该核酶在乳腺癌MCF-7细胞中抑制hTERT的表达和细胞增殖,为核酶应用于恶性肿瘤的基因治疗提供了实验依据和新型工具酶.     

反义人端粒酶催化亚单位基因转染对人结肠癌细胞恶性表型的逆转作用

利用基因重组技术,人端粒酶催化亚单位基因反向插入真核表达载体pcDNA3.0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞.该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G2M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落.说明反义hTRT基因体外导入结肠癌细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的增殖且能使其恶性表型发生逆转.     

肾透明细胞癌关键枢纽基因的筛选及生物信息学分析

目的:旨在通过生物信息学方法筛选与肾透明细胞癌(ccRCC)发生、发展相关的关键枢纽基因.方法:从公共基因数据库下载ccRCC基因芯片数据集(GSE66270)并筛选ccRCC组织与正常癌旁组织样本间的差异表达基因.R软件的clusterProfiler程序包用于差异表达基因的基因本体(GO)功能注释、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.使用STRING数据库、Cytoscape软件构建蛋白互作网络(PPI)并筛选关键枢纽基因.通过GEPIA数据库对关键枢纽基因进行验证和预后分析.结果:共筛选出280个差异表达基因.GO分析结果显示差异表达基因在离子的稳态、跨膜转运和离子跨膜转运蛋白活性中显著富集.KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要参与PPAR信号通路、补体和凝血级联反应以及胆固醇代谢等相关肿瘤信号通路.从差异表达基因中筛选出7个关键枢纽基因,包括3个上调基因C3、CXCR4、CXCL9和4个下调基因EGF、ALB、KNG1、CASR.生存分析结果显示,关键枢纽基因C3和CASR与ccRCC患者的预后不良相关.结论:通过生物信息学方法筛选了与ccRCC发生、发展相...     

黄姑鱼NK-lysin基因的克隆及表达分析

从黄姑鱼转录组数据库中筛选出NK-lysin基因,命名为YdNkl-2。YdNkl-2基因cDNA全长600 bp,其中开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸。YdNkl-2具有一个信号肽和一个鞘脂激活蛋白B（saposin B）结构域。亚细胞定位结果显示,YdNkl-2分布于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,YdNkl-2的mRNA广泛分布于黄姑鱼各组织,其中在鳃和脾脏中的表达量最高。经哈维氏弧菌感染后,头肾、肝脏和脾脏中的YdNkl-2表达量均明显升高,提示YdNkl-2在哈维氏弧菌感染黄姑鱼过程中发挥重要作用。     

酵母表达系统表达外源基因的研究进展

阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景,并对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较．我们认为：甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象,具有良好的应用前景     

人类锌指蛋白新基因ZNF641的克隆及表达

从人类心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个新的人类锌指基因ZNF641,该基因的cDNA序列全长4．9kb,编码一个含438个氨基酸的蛋白质,从进化上看,该蛋白质在从小鼠到人的脊椎动物中都高度保守．Northern Blot分析显示：ZNF641在人类的多数组织中都有表达,尤其是在骨骼肌中有较高水平的表达．而亚细胞定位则显示ZNF641在细胞核及细胞质中均有定位．     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

美容杜鹃RcHsfB3基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE方法从美容杜鹃(Rhododendron calophytum)中克隆到一个热激转录因子(Heat shock factors,Hsfs),命名为RcHsfB3(GenBank登录号KU145694).RcHsfB3基因全长1130bp,完整的开放读码框(ORF)长771bp,预测可编码257个氨基酸,分子量为28.8KD,等电点为5.38.系统进化树分析发现,该基因与其它几种植物的HsfB3基因属于同一分支,氨基酸同源序列比对结果表明RcHsfB3与葡萄的VvHsfB3的同源性最高,达67.29%.原生质体亚细胞定位表明,RcHsfB3编码蛋白定位在细胞核上.荧光定量PCR分析显示,美容杜鹃分别受到热激、低温和盐害胁迫处理后,RcHsfB3的相对表达量总体呈现先上升,后下降,且"上升-下降"交替的表达趋势.初步研究表明RcHsfB3基因受高温、低温和高盐胁迫的诱导表达.     

肾透明细胞癌COX-2、VEGF表达及其相关性研究

目的 探讨肾透明细胞癌（CRCC）的环氧化酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）表达及互相之间的关系。方法 收集经手术病理证实的CRCC石蜡包埋切片32例和正常肾组织切片10例,采用免疫组化S-P法检测COX-2、VEGF表达。结果 CRCC组中COX-2、VEGF表达明显高于正常肾组织组（P〈0．01）;CRCC的COX-2、VEGF两者呈正相关（相关系数为0．609,P〈0．01）。结论 COX-2主要通过促进肿瘤新生血管形成等机制参与CRCC的发生和发展过程,为CRCC临床诊断、治疗和预后判断提供了新思路。     

人端粒酶逆转录酶在大肠杆菌中表达的初步研究

端粒酶是迄今为止最为广谱的肿瘤标志物，是一种良好的肿瘤检测和治疗的靶分子，曾报道了人端粒酶逆转录酶（hTERT) 一个基因片段的表达和相应的抗体用于端粒酶及hTERT检测的研究，为了获得更多针对hTERT不同表位的抗体，根据hTERT的抗源性进一步选取了hTERT的数个片段来制备抗体，这里初步探讨了这些原片段在大肠杆菌中的表达及各种因素对表达的影响，实验结果表明，位于hTERT蛋白中部和C末端的片段可在大肠杆菌中表达，但位于N末端的片段在各种条件下均不能表达，另外，就选取的hTERT各片段而言，诱导条件的优化只能在量上提高表达的水平，不能决定片段是否表达，而密码偏好性，启动子强弱及mRNA二级结构的稳定性可能对片段的表达具有更大的决定作用。     

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F＇中,提取质粒测序,证实序列正确.再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋自在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达.     

甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘，然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中，用G418筛选高拷贝菌株，并进一步对其进行PCR鉴定，获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h，SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin，其大小约为11ku，并具有甜度。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

ApiIa抗菌肽基因的化学合成,克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了ＡｐｉＩａ抗菌肽基因,全长为８０个核苷酸。它被分成４个寡核苷酸片段,分别在ＤＮＡ合成仪上的合成经分离纯化后的寡核苷酸片段经酶促连接,然后被克隆到分泌型载体质粒ｐＡＦＤ１０１上,经限制酶酶切,ＰＣＲ模板检测以及双链ＤＮＡ序列分析检测,证明合成的ａｐｉＩａ基因和设计的完全一致。     

一个新的PMA诱导相关基因在Pichia pastoris酵母系统中的表达

利用包含 40 96条各种人类基因的DNA芯片研究了代谢增强剂PMA(phorbolmyristateacetate)激活的人单核巨噬细胞HTP 1的早期应答基因 ,根据已有的旧基因信息 ,实验结果基本反映了人单核巨噬细胞早期应答基因的表达谱 .选取其中一条候选早期应答基因为后续研究对象 ,并进行蛋白质的酵母表达 ,为下游的基因功能研究奠定一定的基础 .     

人血管生成素样蛋白4在毕赤氏酵母中的表达及其生物活性的初步研究

将编码人的血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上,在Pichia Pastoris酵母宿主菌SMD1168中获得分泌表达;用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明,发酵液中分泌表达的重组蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞的生长具有一定的抑制作用．     

人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析

应用PCR技术从人胎肝cDNA库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GSll5，经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GSll5(pPIC8KA3)。再用G418筛选法，在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS—PAGE及Westem印迹分析显示：表达产物约占胞外蛋白的43％，相当于94mg/L，并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。