基于生育酚修饰的低分子量聚乙烯亚胺基因载体

制备了基于生育酚交联的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)可降解脂质体聚合物基因载体。凝胶阻滞实验结果表明它能很好地包裹质粒DNA,使其免受核酸酶的降解。通过在体外He La细胞和HEK 293细胞中的绿色荧光蛋白转染实验结果表明,这种生育酚修饰的聚合物材料在无血清存在下表现出比"黄金标准"PEI高的转染效率。因此,推测这种材料具备了作为非病毒基因载体的潜在性。     

PEI介导pCEP4/EGFP瞬时转染293-F细胞条件优化

为构建真核表达载体pCEP4/EGFP,PEI介导瞬时转染293-F细胞,观察转染效率,优化转染条件.通过NotI和Hind III酶切位点将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)插入真核表达载体p CEP4中,并转化Trans5α感受态细胞,氨苄青霉素筛选培养,挑取阳性克隆扩增后提取质粒,酶切鉴定正确后,PEI介导转染293-F细胞,流式细胞仪检测转染效率.实验结果表明,成功构建了真核表达载体pCEP4/EGFP,当N/P(PEI/DNA)为25,悬浮培养模式下转染293-F细胞,48 h转染效率为77.57%,重组载体p CEP4瞬时转染293-F细胞,可获得理想转染效果.     

高分子聚合物对两种细胞转染效率的研究

比较纳米材料和阳离子多聚物转染试剂携带增强绿色荧光蛋白基因对C2C12细胞和DF-1细胞的转染效率,筛选适合的基因载体。采用Entranster TM-D纳米材料和3种阳离子多聚物(Superfect、Fect、Neofect)转染试剂介导p CDH-EGFP-puro质粒分别转染C2C12细胞和DF-1细胞,24 h后用实时荧光定量核酸扩增检测系统检测转染细胞中增强绿色荧光蛋白基因的mRNA表达水平,48 h后观察并计数阳性细胞率。结果发现4种试剂分别转染的两种细胞中均有增强绿色荧光蛋白基因的表达。C2C12细胞用阳离子多聚物转染的效率略高于纳米材料转染,其中Superfect的转染效率可达到30%;DF-1细胞用纳米材料和阳离子多聚物转染的效率都高,其中Fect的转染效率达到50%。因此,阳离子多聚物Superfect用于C2C12细胞的体外转染,Fect转染试剂用于DF-1细胞的体外转染,都表现出较高效的转染效率     

流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

为探究脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率,并获得最佳的优化方案,本研究选取不同配比的质粒和脂质体浓度,将p-EGFP-C1质粒转入MDCK细胞。转染后36h,利用台盼蓝染色法检测细胞活率,流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率,获得优化的转染条件。结果发现,转染后MDCK细胞,实验组细胞活力与阴性对照组差异不显著(P>0.05)。当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度配比为0.5∶1.0、0.5∶1.25、0.5∶1.5时,转染率达到了较高水平,分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%,从经济因素考虑,脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶1.0。这为MDCK细胞用于基因转染提供了一定的理论基础。     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

线性与分枝状聚乙烯亚胺介导基因体外转染的比较与研究

聚乙烯亚胺(PEI)是一类新兴的阳离子多聚物非病毒载体,可缩聚DNA分子形成颗粒并转入真核细胞进行表达.本文选用分子量750 ku分枝状PEI与分子量25 ku线性PEI转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因于HeLa细胞,并对这两种PEI的转染效率进行比较.利用MTT法检测比较线性PEI与分枝状PEI的细胞毒性.通过凝胶阻滞实验比较两种PEI结合DNA能力.最后利用肝素介导释放实验比较两者在形成PEI/DNA复合物后释放DNA的能力.研究结果表明:线性PEI转染效率优于分枝状PEI,且随PEI/DNA质量比的增加而升高,而分枝状PEI则相反;两种PEI细胞毒性在一定范围内相近;分枝状PEI结合DNA能力略强于线性PEI;但是分枝状PEI释放DNA的能力远小于线性PEI.这可能导致DNA在细胞内无法从PEI/DNA复合体上释放出来,从而影响转录的正常进行,最终导致分枝状PEI转染效率下降.     

基于“科教融合”的化学生物学综合实验设计

将科研成果转化为化学生物学综合实验,探究细胞模型对药物毒性检测的影响。实验在体外建立了单层细胞(2D)和三维细胞(3D)培养模型,通过ATP生物荧光法检测阿霉素(Doxorubicin,DOX)在HepG2 2D和3D细胞模型中的毒性。结果显示,DOX对3D细胞球的毒性远远低于2D细胞。激光共聚焦成像分析发现,细胞模型对药物的摄取存在明显的影响。该实验体现了体外细胞模型的构建、三维细胞活力检测、药物摄取及分布分析等前沿领域的相互融合。通过实验有助于让学生了解科学研究的全过程,提高学生的科学素养和实践能力。     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。     

慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定

研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。     

研究G偶联蛋白受体G2A功能特定细胞模型的建立

通过克隆人质子感知受体G2A基因、构建G2A基因的表达载体并瞬时转染293T细胞,建立G2A受体调控机理及其功能研究的转基因细胞模型,并检测G2A介导的细胞应答.从人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)中提取总RNA,反转录为cDNA为模板,设计一对针对G2A基因的引物,克隆不含终止密码子的G2A基因并亚克隆到pMD-19T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pEGFP-N3用HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pEGFP-N3-G2A,并测序鉴定;重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞.Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达;ELISA检测转染与未转染G2A基因的细胞内三磷酸肌醇(Inositol-1,4,5-triphosphosate,IP3)的含量.测序和酶切证实了克隆到G2A基因并获得pEGFP-N3-G2A表达载体;荧光成像与Real time PCR证实在293T细胞中过表达G2A基因;ELISA检测在酸性刺激下转基因细胞内IP3含量(应答)明显升高,而脂质配体LPC则抑制其IP3的积累,本研究为G2A受体介导信号机制及其功能研究提供一个真核细胞模型.     

汉滩病毒受体与细胞因子TNFRⅠ真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

摘要 目的：构建带有荧光标签的汉滩病毒受体整合素β3与细胞因子TNFRⅠ的稳定转染细胞系。方法：构建目的基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-β3和pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC),并转染CHO细胞,直接荧光观察报告基因和荧光定量RT-PCR检测目的基因mRNA表达。结果：转染重组质粒pIRES2-EGFP-β3的细胞可检测到荧光报告基因和目的基因β3 mRNA的表达,转染pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC)的细胞可检测到荧光报告基因和目的基因TNFRⅠmRNA的表达。结论：成功构建真核表达整合素β3与TNFRⅠ的稳定细胞系。     

脂质体转染人肝星状细胞和肝细胞条件优化

利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导LacZ及EGFP基因转染人肝星状细胞系LX-2和人肝细胞系Chang Liver,探讨Lipo用量、质粒用量、转染时间、细胞初始接种密度及不同启动子驱动对转染效率的影响.结果显示,两种细胞均能得到高效转染,Chang Liver细胞转染效率(80%)高于LX-2细胞(60%).Lipo用量为每孔2μL,转染后6 h换液,LX-2细胞应用质粒DNA为每孔0.45μg,Chang Liver细胞应用质粒DNA为每孔0.30~0.45μg,此时转染效率最高.巨细胞病毒(CMV)启动子驱动LacZ转染效率与CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染效率无显著差异;细胞初始接种密度对转染效率无显著影响.     

聚乙烯亚胺介导生存素反义核酸体外投递肝癌SMMC-7721细胞的条件优化

目的:探讨聚乙烯亚胺(polyethylene im ine,PEI)作为生存素(survivin)反义核酸(anti-sense oligodeoxynuc leotides,ASODN)的载体投递肝癌SMMC-7721细胞的条件。方法:凝胶阻滞实验筛选PEI与survivin ASODN形成静电复合物的最佳质量比;W ST-8法检测PEI对肝癌细胞的毒性;流式细胞仪及W ST-8法筛选荧光标记的PEI与ASODN在不同质量比时的瞬时转染效率及48 h转染效率;流式细胞仪及荧光显微镜分别检测荧光标记的ASODN以及PEI-ASODN复合物进入细胞的情况;W ST-8法检测血清对PEI转染效率的影响。结果:m(PEI)∶m(ASODN)为0.625∶1~2.5∶1时可以形成电中性状态的静电复合物;PEI终质量浓度≤4μg/mL对肝癌细胞的毒性较小;m(PEI)∶m(ASODN)为0.75∶1时转染效率最高;血清存在对PEI转染效率无明显影响。结论:PEI是一种低毒的ASODN投递载体,其终质量浓度≤4μg/mL可作为肝癌细胞的转染载体,血清条件下m(PEI)∶m(ASODN)为0.75∶1时,PEI携带sur...     

高效转染HepG2细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

为构建含绿色荧光蛋白(EGFP)和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达,将IRES-EGFP片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体(pLXSN-GI-Ins)中,构建得到表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.经脂质体介导转染HepG2细胞后,各孔分别加入含有30.0 mmol/L葡萄糖的培养液继续培养24 h,在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值.数据显示,成功构建逆转录病毒表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.转染HepG2细胞后48 h,表达EGFP基因的细胞数目占总细胞数目的比值为(38.0±5.0)%.结果表明,构建了含EGFP和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体,并且能够在HepG2细胞中成功表达.     

纳米谷氨酸壳聚糖制备及其体外质粒转染研究

采用表面修饰方法制备出谷氨酸修饰的壳聚糖纳米基因载体。对样品进行红外分析、粒度分析、zeta电位分析、生物相容性、凝胶阻滞分析、DNA保护性试验、体外细胞转染研究。结果显示所制得的谷氨酸修饰的壳聚糖纳米颗粒平均粒径为170nm,其zeta电位为 4.7mV。红外分析显示谷氨酸已通过酰胺键结合在壳聚糖上。MTT实验结果显示纳米颗粒与细胞有良好的生物相容性。凝胶阻滞分析和DNA保护试验结果表明纳米载体可与DNA通过电性结合作用而结合,并可以有效保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用。而体外细胞转染的结果表明,谷氨酸修饰的纳米粒能介导pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白。因此,谷氨酸修饰的壳聚糖纳米颗粒可作为一种新型非病毒基因载体介导核酸类生物大分子进入细胞内。     

c-fos启动子与GFP重组质粒的构建及在Pc12细胞中的表达

目的：构建c—fos启动子与GFP的重组质粒载体,并使其在体外培养哺乳动物pcl2细胞中表达．方法：Xba I、Hind Ⅲ双酶切含c—fos启动子的HF443质粒,纯化后与同样双酶切的绿色荧光蛋白基因连接;利用Lipofect AMINE 2000将重组质粒转染体外培养哺乳动物pcl2细胞．结果：加入Na^ 通道激活剂乌头碱后,转染后的pcl2细胞可发出较强的绿色荧光．结论：c—fos启动子与GFP重组质粒构建成功,并可用于哺乳动物活细胞c—fos基因的检测．     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接，构建CREPT基因敲除质粒；体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体；体外切割实验结果显示，以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β/Fc蛋白的条件优化

为优化HEK293F细胞瞬时转染条件,提高PDGFR-β的蛋白表达量,采用聚乙烯亚胺(Polyetherimide,PEI)为转染试剂,将质粒p XLG-PDGFR-β/Fc与PEI混匀聚合后加入到细胞悬液,37℃,φ=6%CO2,180 r/min悬浮振荡培养,培养7 d后收集样品,ELISA检测PDGFR-β蛋白的浓度。对细胞密度、DNA浓度和m(DNA):m(PEI)、聚合时间以及添加物(丙戊酸钠、葡萄糖和蛋白胨)进行优化。结果显示,HEK293F细胞瞬时转染的最佳条件为:细胞密度4×106cells/m L、DNA浓度2.0μg/106cells、m(DNA):m(PEI)为1:2、聚合时间5 min。同时,48 h内添加3 mmol/L丙戊酸钠,第3天补加葡萄糖和1 g/L的蛋白胨TN1可使PDGFR-β/Fc的蛋白表达量明显提高。实验表明,经过对HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β的转染条件的优化,蛋白表达量可达55 mg/L,为更大规模瞬时转染生产PDGFR-β/Fc蛋白奠定了基础。