水稻磷转运蛋白基因OsPht1;6启动子表达载体转化系统的建立

通过PCR从粳稻（Oryza sativa L.cv.ssp.Japonica）的总DNA中扩增出一个磷转运蛋白基因（Phosphates transporter1；6；OsPht1；6，accession no AF536966）的启动子序列.以此为基础与二元表达载体PS1aG-3构建含Pht1；6启动子的植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导转化了水稻武运粳7号品种.同时，对其愈伤组织高效再生体系和影响报告基因GUS瞬时表达的各种因素也做了比较研究.结果表明：①诱导水稻武运粳7号品种愈伤形成，3 mg/L 2，4-D的生长素浓度最适宜；②GUS基因高瞬时表达频率的条件为：工程菌液的浓度OD600值为0.7-0.8，浸染时间30 min，共培养时间3 d.利用这些再生转化条件，以EHA105为菌株转化浸染愈伤组织，获得了较高频率的Pht1；6启动子驱动的GUS基因瞬时表达.这些方法都有效地提高了抗性愈伤组织的形成率，该实验获得了转基因植株，经PCR检测，证实已将目的基因整合到水稻的基因组中.     

根癌农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位研究

采用根癌农杆菌介导的方法,以受控于CaMV35S启动子的携带有GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1300-35S-GFP转化洋葱表皮细胞.荧光显微镜下观察结果显示,GFP基因在经浸染和共培养后的洋葱表皮细胞中得到了表达,绿色荧光分布在细胞核和细胞质中,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础.     

原球茎为转化受体的农杆菌介导石斛遗传转化

以携带双元载体pCAMBIA1305.1的农杆菌菌株EHA105转化石斛种子萌发形成的原球茎,通过GUS瞬时表达检测对受体状态、农杆菌活化条件、共培养时间等转化影响因子进行了优化;共培养4 d的原球茎接种到含有30 mg/L潮霉素(Hyg)和500 mg/L头孢噻肟钠的愈伤组织诱导与增殖培养基上以获得潮霉素抗性的愈伤组织,抗性愈伤组织在含Hyg 50 mg/L的再生培养基上再生植株,抗性株经GUS组织化学、PCR和PCR-southem blot检测证明为转化株。     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

用CRISPR/CAS9系统构建原位表达dPit:GFP的果蝇品系

SLC20A2基因是Ⅲ型纳磷转运蛋白2(PiT2)的编码基因,PiT2可将无机磷从细胞外运送至细胞内.SLC20A2基因突变导致PiT2不能正常地将无机磷运送到细胞内,血液中的无机磷含量升高,磷和钙离子结合形成沉淀,堵塞血管.SLC20A2基因在果蝇中的同源基因是CG42575(dpit).本实验使用CRISPR/CAS9系统,构建原位表达dPiT:GFP的果蝇品系,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)编码序列插入dpit基因末端,使果蝇表达dPiT:GFP融合蛋白.该融合蛋白可以被dPiT及GFP的抗体同时识别,通过荧光直接观察dPiT:GFP的位置,从而准确定位dpit,进而为dpit基因的功能研究提供基础.     

影响根癌农杆菌介导的香蕉基因转化早期的主要因素

用含质粒载体pCAMBIA2301的根癌农杆菌（Agrobacterium inoculation）转化“641”香蕉（Musa AAA Cavendish subgroup cv.64-1）的薄片外植体，通过测定GUS基因瞬时表达率，对转化早期的主要影响因素进行了研究。结果表明：农杆菌EHA105较适合于介导转化，将薄片置于固体高渗培养基上培养4h后，通过真空减压法使农杆菌接种于其上，获得了较高的瞬时表达率（41.67%），是对照（8.33%）的5倍，农杆菌悬液稀释5倍用于转化较好，共培养3d为宜，薄片外植体越靠近根部，瞬时表达率越高。而外植体预培养会降低瞬时表达率。     

CMV启动子克隆及其在植物体内的表达

根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.     

农杆菌介导的花生遗传转化体系的初步研究

应用花生胚小叶再生体系,以农杆菌介导法对质粒上的基因转化进行初步探讨.通过对影响基因转化的各因素,如抗生素的筛选压、共培养时间、AS的影响、及外植体取材方式等进行研究,结果发现:外植体与农杆菌在加有AS(100μmol/L)的改良MS液体培养基中共培养4 d后,先进行10 d的恢复培养,继而转入加有Hy(25 mg/L)和Cef(200 mg/L)的抗性筛选培养基中进行筛选培养40～50 d,后转入含Hy(20 mg/L)的分化培养基中分化,3个月后在首批材料中得到6个再生植株,经PCR检测,有1株显示了800 bp的GUS基因核酸片段,初步证实了此转化体系合理有效.     

人β-防御素-2植物表达载体的构建

用重组基因 (hBD 2 )替换双元载体 pCAMBIA130 4中的GUS GFP基因 ,构建成植物表达载体pCAMBIA130 4 hBD2 ,并经过了酶切、PCR和序列分析验证 .该载体的构建可为培育转基因抗病植物和利用生物反应器生产防御素奠定基础 .     

毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

基因枪法转化香蕉薄片外植体的参数优化

采用果用香蕉（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）的薄片外植体作为转化受体，通过对ＧＵＳ基因瞬间表达的研究，找出了较适合的轰击条件和外植体培养条件，研究表明，高渗处理对转化的影响较大，轰击前后对体外植体进行高渗处理的瞬间表达率（１４．１１％）是对照（３．６８％）的３．８６倍。预防培养外植体转化的瞬间表达率（１７．５％－４２．１１％）普遍高于没有预培养的外植体（１２．２０％），并以预培养６ｄ为好。最适压力和射程分别     

根癌农杆菌介导苜蓿体胚转化及转基因植株再生

用含质粒载体pCAMBIA2301(带有受CaMV35S启动子调控的GUS基因和nptⅡ基因)的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens转化晋南苜蓿Medicago sativa L.cv.Jinnan的体胚组织,发现负压处理有利于提高转化频率(可达35%),3批共158个体胚切块的转化实验共获得具有卡那霉素抗性的再生植株15株,经组织化学染色和分子检测,证实GUS基因已整合到转化植株基因组中,在芽、叶片、叶柄和根等组织中均有表达,并在土壤栽培过程中保持稳定的表达.     

Transformation of plant young proembryos by electroporation

It is first reported that plant young proembryos expressed exogenous reporter genes by electroporation. Young proembryos with 8–32 cells and globular proembryos with 250–400 cells could be isolated by enzymatic maceration combined with microdissection. After electroporation withGUS orGFP genes, the proembryos were cultured for 1–2 d in KM8p medium. At the field strength of electroporation 500–1500 V/cm, blue reaction of GUS or green fluorescence of GFP could be observed in the proembryos. The highest transient expression frequency of young proembryos (2.2%) was obtained at the field strength of 750 V/cm, whereas the highest frequency of globular proembryos (5.9%) was obtained at the field strength of 1 250 V/cm. Taking the proportion of transformed cells in the whole cells of proembryos as efficient transformation frequency, the efficient transformation frequency of the young proembryos was 7 times that of the globular proembryos.     

小鼠液胞H~+-ATPase 15 K启动子(M15 K)的克隆及其在植物体内的表达特性研究

PCR克隆了小鼠液胞H+-ATPase 15K启动子,构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPMG.通过M15K启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:M15K启动子可启动GUS在植物体内的表达.其表达活性相当于2×35S启动子的87.0%±17.3%.     

Increase of Expression Levels of Reporter Gene in Transgenic Tobaccos by Matrix Attachment Regions

The matrix attachment region (MAR) located downstream of Plastocyanin gene was isolated from the genome of pea. To study the effect of MARs on foreign gene expression in transgenic plants, T-DNA vector was constructed in which MARs flanked bothβ-glucuronidase(GUS) gene and selectable marker neomycin phosphotransferase (NPT-II) gene. The plant expression vectors were transferred into leaf discs via Agrobacterium-mediated transformation procedure. The result of GUS measurement showed that pea MAR could increase transgene expression level. The mean expression levels of GUS gene expression in population containing MARs could be increased twofold when compared with that of population without MARs.     

拟南芥VHA-c3基因的特异性表达和调节

利用RT-PCR技术检测VHA-c基因在拟南芥中的表达,结果表明VHA-c3基因在拟南芥的果荚、花、叶、茎和根中都有表达,但是,在叶中的表达量远远高于其它的组织.以GUS基因作为报告基因构建了不同长度的VHA-c3基因启动子缺失突变体,利用农杆菌介导的瞬时表达系统检测GUS基因的表达,研究发现在VHA-c3基因起始密码子上游2812-2 234 bp之间的区域內存在着控制VHA-c3基因高表达的转录调控元件.     

SCFP,a novel fiber-specific promoter in cotton

To investigate the expression pattern of GhSCFP which was isolated from cotton fiber cDNA library, a 1006 bp upstream fragment of the gene was cloned by chromosome walking and fused to GUSand GFP respectively. Histochemical GUS and GFP fluorescence analysis revealed that the expression of the report genes driven by the promoter sequence was detectable only in outer layer cells during the seed development in the transgentic tobaccos. In transgenic cotton, strong GUS activity was observed in spherical protrusions on 0 dpa （days post anthesis） ovule surface, and in the 2-36 dpa fiber cells, while no GUS signals were detected in the root, leaves, stem, corolla, anther and stigma. Our data demonstrated that GhSCFP upstream sequence is a cotton fiber-specific promoter and this promoter will be useful in the molecular research on fiber cell development and in cotton fiber improvements by genetic modification.     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。