大豆GmNHX1在百脉根中的过表达研究: 体内Na+含量的降低是耐盐性提高的基础

从大豆中克隆到了液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白编码基因(GmNHX1)的全长cDNA, 包括5′端非翻译区464 bp, 编码区1641 bp, 3′端非翻译区486 bp, 共2591 bp. 该cDNA编码的GmNHX1蛋白共546个氨基酸, 具有典型的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白特征, 与已知功能的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白AtNHX1, OsNHX1及AgNHX1具有较高的同源性. GmNHX1在大豆基因组中为单拷贝基因, 其表达具有组织特异性, 并能受到NaCl, KCl, LiCl, ABA以及脱水等胁迫上调; 耐盐品种GmNHX1的转录水平在叶片中低于而在根系和下胚轴中均高于敏盐品种. 将GmNHX1 cDNA置于两个串联的CaMV35S启动子控制下在豆科模式植物百脉根中过表达, 提高了转基因百脉根的耐盐性. Na⁺及K⁺含量测定表明, 与对照相比, 过表达GmNHX1的百脉根小苗中Na⁺, K⁺含量显著降低, K⁺/Na⁺比率显著增加, 显示了百脉根中过表达GmNHX1所导致的耐盐性与减少转基因植物中Na⁺的积累有密切关系.     

NCED3基因的持续诱导及ABA合成与代谢的协同调控在拟南芥ABA信号积累中的作用

ABA作为逆境信号在植物抗逆特别是抗旱中起着重要的作用. 由于ABA生物合成是ABA信号产生的根本基础, 因此ABA合成关键酶基因NCED3的启动一直被认为是操纵ABA信号产生的惟一机制. 本研究报道了ABA信号累积中ABA代谢和合成的协同操纵机制. 结果表明, 水分胁迫可导致拟南芥叶片中ABA水平急剧增加, 且在长期干旱胁迫情况下, ABA累积的最高水平始终处于一个相对稳定的状态. 无论是胁迫还是非胁迫状态下, ABA代谢都呈现指数递减规律, 且其代谢的半衰期没有太大的变化, 这意味着干旱条件下ABA的绝对代谢速率将随ABA水平上升而急剧加快, 由此可以推断ABA信号的产生是一个由多酶共同操纵的系统控制, 且NCED3的持续诱导是ABA信号稳定积累的前提. 进一步研究表明, 干旱可诱导一系列ABA合成酶的基因表达, 其中包括NCED3, AAO3和ABA3等. 伴随ABA的持续积累, NCED3, AAO3和ABA3的基因始终处于诱导表达状态. ABA代谢研究和基因表达分析结果相互印证, 共同揭示ABA信号的产生机制是一个由多酶共同参与, 且以ABA合成关键酶基因持续诱导为前提的操纵机制, 其中ABA代谢在ABA信号的操纵中起着重要的作用.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶. 采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321, 通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达. 抗盐抗旱检测结果表明, 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸, 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5~15倍; 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快, 苗与根的生物学产量都要高于对照, 最后种子产量也显著高于对照, 如在0.1 mol/L NaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%~41%, 说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用, 通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

西藏喜马拉雅冷杉年轮δ 13C与气候意义

对采自青藏高原东南部林芝地区的喜马拉雅冷杉进行交叉定年后, 分析了喜马拉雅冷杉年轮 δ ¹³C序列与气候要素之间的关系. 去除大气CO₂浓度升高导致大气CO₂中δ ¹³C下降和生长趋势的影响后, 建立树轮δ ¹³C值的残差序列Δ¹³C. 利用附近林芝气象站的气象资料, 分析了树轮Δ^{13C序列对气候要素的响应. 结果表明: 冷杉δ 13C的高频振荡与该地区前一年的9～11月降水和相对湿度存在较好的相关性, 并存在强的滞后效应. 通过建立回归方程重建了该区域的秋季(9～11)月相对湿度序列, 解释方差达37.9%. 重建相对湿度序列表明1800年前相对湿度变化周期较短、变幅较小, 1800～2000年则相反.}     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价

以Q105, WW51, 115F, V26-2, 919J为Mutator转座子供体材料, 与本地优良玉米自交系受体材料Hz85, W328以及S-Mo17^Rf3Rf3杂交, 获得26718单株的插入诱变F₁群体(M1). 田间鉴定M1单株的生物学特征及农艺学性状的表型突变, 室内考察突变单株自交果穗M2籽粒性状的突变类型, 并以斑点籽粒出现的频率评价Mu因子的转座频率. 结果表明, 在所构建的Mu介导的玉米插入突变体库中, 以W328为母本(BzBz)的M1群体平均田间表型突变频率为0.07; 以W328 × Mu的M2果穗斑点籽粒的出现频率评价的Mu转座频率为0.121802; 在22500个S-Mo17^Rf3Rf3 × Mu单株中, 发现了5个S型玉米细胞质雄性不育突变单株, 突变频率为2.2×10^-4. 利用优化的MuTAIL-PCR技术分析了99条转座子插入位点的侧翼序列, 归并整理后获得59条(每条约400核苷酸序列)非重复靶位点序列. 对59条序列非重复的Mu因子插入产生的9 bp靶位点正向重复序列进行同源性比较分析, 结果表明, Mu的插入有序列热点. 经生物信息学分析后注释了27条与玉米、水稻等植物核苷酸数据库中匹配值较高的功能序列. 利用比较基因组学方法将36条单一基因序列定位在玉米遗传图谱上, 有多条Mu插入靶位点序列定位在单个标记位点上. 分析发现, 8条Mu插入靶位点序列的预测功能与其相应的定位标记的功能具有一致性. Mu插入突变体库的构建与遗传评价为利用Mu转座子进一步发掘玉米基因、深入开展玉米功能基因组学研究搭建起重要的技术与材料平台.     

红树植物耐盐基因转化烟草及耐盐品系的培育

从耐盐性强的红树植物白骨壤(Avicennia marina)中分离出的耐盐基因CSRG1, 构建了pGAM189/CSRG1转基因载体. 以烟草嫩叶为外植体, 通过农杆菌介导的叶盘转化法将CSRG1基因及GUS基因, Km^r基因和Hyg^r基因转入烟草基因组中. 转化50个外植体, 经过50 mg/L潮霉素和150 mg/L卡那霉素抗性筛选共获得了13个稳定抗性株系. 通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测, 结果表明, 最终获得的11个转基因品系(基因转化频率为22%)中, CSRG1基因整合到烟草的染色体DNA上. Northern blot分析结果表明, CSRG1基因在转基因植株中获得表达. 耐盐性测定和光合速率测定结果表明, 转基因植株在盐分提高到2% NaCl和全海水(盐度为24)配置的MS培养基中, 成活率保持在80%~90%, 株高增长20%~40%, CSRG1基因的表达产物及形成的生理代谢途径确实可使烟草获得较高的耐盐性, 同时这种耐盐性不仅针对钠离子胁迫, 而且对于各种离子的综合盐胁迫都具有耐受性.     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

那曲河流域季风结束前后大气水汽中δ 18O变化特征

在青藏高原中部那曲河流域2004年8~10月收集了大气水汽样品. 研究结果表明, 该流域大气水汽中 δ ¹⁸O值存在一定的波动, 尤其在季风撤退前后, 波动最为显著. 而且大气水汽中δ ¹⁸O与露点温度的波动趋势是明显反向的. 降水事件对该流域大气水汽中δ ¹⁸O波动具有绝对的影响. 在整个大气水汽样品收集时段, 降水发生时, 大气水汽中δ ¹⁸O都为低值. 不同的水汽来源对该流域大气水汽中δ ¹⁸O具有一定的影响, 特别是强烈的西南季风活动带来的海洋性水汽导致该流域大气水汽中δ ¹⁸O出现相对低值, 而当该流域主要受大陆性水汽影响时, 大气水汽中δ ¹⁸O相对较高.     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

天气尺度下丽江季风降水中δ18O变化

根据丽江2003年夏季日降水中δ¹⁸O资料, 结合日平均NCEP/NCAR再分析资料, 研究天气尺度下季风降水中δ¹⁸O变化. 研究发现, 丽江夏季日降水中δ¹⁸O变化具有显著的“降水量效应”, 而“温度效应”不存在. 季风活跃期和不活跃期的交替出现可能对天气尺度下δ¹⁸O的变化具有显著的影响, 同时季风降水的再循环过程可能对季风末期降水中δ¹⁸O变化具有显著的影响. 这些影响对季风降水中稳定同位素所特有的“降水量效应”产生严重干扰. 另外, 研究表明丽江夏季天气尺度下δ¹⁸O变化主要受大尺度印度低压系统控制. 研究结果对于季风区稳定同位素“降水量效应”以及本区古气候的研究具有重要意义.     

季风降水中δ18O与高空风速关系

统计分析了西南季风区IAEA/WMO降水观测站曼谷、孟买、新德里、昆明及拉萨夏季降水中δ¹⁸O资料及各站高空大气风速资料发现, 高空风速与δ¹⁸O之间存在显著的正相关关系. 分析表明, 季风期间季风区上空存在一个季风水汽层, 雨滴在下落过程中通过这一水汽层并与季风水汽发生稳定同位素交换, 是导致高空风速和δ¹⁸O正相关的主要原因. 在西南季风区除温度和降水量外, 高空风速也是影响季风降水中δ¹⁸O变化的一个主要因子.     

利用稳定氮和碳同位素分析渤海湾食物网主要生物种的营养层次

本研究利用稳定氮和碳同位素比值构建了渤海湾食物网主要生物种的营养层次. 其中, δ¹³C值范围为-25.38‰~-11.08‰, 并且在水生生物体内没有稳定的富集现象, 梭鱼的生活习性(洄游经济鱼种)和食性可能导致其δ¹³C值明显高于其他鱼种. δ¹⁵N值范围为4.08‰~13.98‰, 随营养层次升高有明显富集趋势, 富集因子为3.8‰. 利用δ¹⁵N建立了稳定同位素比值与营养层次的关系模型, 预测出浮游动植物、无脊椎生物、鱼类和海鸟的营养层次分别为1.46~2.10, 1.91~3.32, 2.55~4.23和2.98~4.28.     

广西桂林垌村上泥盆统碳同位素正偏移与全球一致性的记录

目前的研究显示, 欧、美等大陆晚泥盆世地层中普遍存在碳同位素δ¹³C的正偏移, 这种偏移已被推测为全球海洋有机碳埋藏速率快速增加的结果, 并与晚泥盆世弗拉阶(Frasnian)-法门阶(Famennian)之交发生的生物集群灭绝事件(简称F-F事件)密切相关. 华南上泥盆统是研究F-F事件理想地层之一, 其中是否存在δ¹³C正偏移, 直接关系到全球范围内是否存在与F-F事件有关的有机碳埋藏增强的问题.对广西桂林垌村具有生物地层控制的晚泥盆世剖面进行了高分辨率的碳酸盐稳定同位素分析, 结果表明: δ¹³C在F-F转换时期总体呈逐步增加趋势, 这种趋势由两次明显的d13C正偏移组成: 第1次正偏移出现在linguiformis带的底界, δ¹³C增加幅度达1.5‰; 第2次正偏移出现在triangularis/linguiformis带(F-F)的界线, 增幅达2.1‰. 与世界其他地区的同位素记录对比发现, 在生物地层时限上, 垌村剖面第1次出现的δ¹³C正偏移较晚, 而发生在F-F界线的第2次正偏移, 无论在生物地层上还是在变化幅度上都是基本一致的, 支持F-F时期全球性的有机碳埋藏增强的观点.     

海岛棉GbKTN1对酵母细胞伸长的影响

用5′RACE/3′RACE从海岛棉(Gossypium barbadense)开花后10 d的纤维细胞中分离获得了GbKTN1 cDNA序列, 全长2006 bp, 包括113 bp的5′非翻译区、1563 bp的可读框及327 bp的3′非翻译区(不包括终止密码子TAA). 可读框编码521个氨基酸, 蛋白质分子量约为55 kD, 靠近GbKTN1 C末端的233~414 氨基酸残基间包含一个ATP结合功能区. Southern杂交证明, GbKTN1在海岛棉基因组中以单拷贝形式存在. 半定量RT-PCR结合Southern杂交分析表明, GbKTN1在海岛棉根、茎、叶及纤维细胞中均有表达, 以纤维细胞中的表达最高, 叶中最低. 利用裂殖酵母系统, 初步分析了GbKTN1对细胞伸长的功能, 发现该基因在酵母细胞中诱导表达后使细胞显著伸长, 平均为诱导前的2.18倍, 部分细胞呈不规则形状, 这是首次在活体(in vivo)中证明KTN1与细胞的伸长有关.     

衣藻细胞色素b559 α 亚基Ser24残基定点突变影响PSⅡ光合放氧活性

为研究细胞色素b₅₅₉ (Cyt b₅₅₉)在光合系统中的功能, 采用大引物定点突变技术, 将衣藻叶绿体Cyt b₅₅₉ α亚基(psbE基因编码)中与组氨酸(His²³)相邻的氨基酸残基丝氨酸(Ser²⁴)定点突变为苯丙氨酸(Phe), 获得突变体S24F. 对突变体的生理生化分析表明, S24F既能进行光合自养也能进行光合异养, 但是在自养和异养条件下, 其生长速率比对照慢; S24F的PSⅡ放氧活性约为野生衣藻细胞的71%, S24F的光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率F_v/F_m比野生型对照低约0.23. 此外, 相比野生型对照, 突变体S24F对强光更加敏感; SDS-PAGE和Western杂交的结果表明, 对Cyt b₅₅₉ α亚基中Ser²⁴的定点突变影响了Cyt b₅₅₉ α亚基及其他膜蛋白, 如LHCⅡ和PsbO等的表达. 上述结果说明, 虽然Ser²⁴残基并不参与血红素配位, 但其对维持PSⅡ的活性具有重要作用.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性

通过定点突变及基因替代技术, 将肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)野生型菌株的固氮酶钼铁蛋白α亚基中铁钼辅因子(FeMoco)周围多肽链的Glnα190和Hisα194分别置换为Lys和Gln, 并构建成2个单突变株,命名为Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q. 将上述2个突变分别引入Kp-nifV突变株(与FeMoco相连接的高柠檬酸被柠檬酸置换)获得另外2个双突变株, 命名为Kp-Qα190K-nifV^−和Kp-Hα194Q-nifV^−. 对上述4种突变株进行诱导培养和细胞的固氮酶活性分析表明, 4种突变株都失去了固氮活性, 乙炔(C₂H₂)还原活性也大幅度降低, Kp-Qα190K单突变株的乙炔还原活性比Kp-Hα194Q单突变株下降得多; Kp-Qα190K-nifV^−双突变株几乎完全丧失了活性, 而Kp-Hα194Q-nifV^−野生型菌株10%的乙炔还原活性. 突变株将氘代乙炔(C₂D₂)还原成氘代乙烯(C₂D₂H₂)的情况是: Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q-nifV^−突变株的C₂D₂还原产物中, 反式-1,2-二氘代乙烯比例比Kp野生型增加了1倍, 表明固氮酶催化加氢的立体构型选择性降低. 以上结果表明, 固氮酶活性中心周围多肽环境中Glna190残基, 及与FeMoco相连的高柠檬酸, 可能直接参与质子和/或电子向活性中心FeMoco的传递. 推测Glna190和与FeMoco的Mo原子相连的高柠檬酸, 在质子和/或电子通过Mo位进入FeMoco起关键作用. 这种双突变株所产生的固氮酶, 有利于在体外研究固氮酶的催化机制, 可以通过分析用于还原底物的电子和质子进入活性中心FeMoco的位点, 推测出底物在活性中心中的络合和还原的部位.