应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应(PCR)的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

植物高度同源重复基因的PCR检测

以油菜中三个同源性高达90%以上的AP3基因为研究对象,采用三种不同的DNA聚合酶进行常规PCR扩增和纳米PCR扩增.结果显示：纳米PCR比普通Taq DNA聚合酶和低保真Plus DNA聚合酶具有更高的扩增特异性,即在相同的退火温度下,只有纳米粒子PCR扩增出特异性的目的产物而无非特异性产物; 虽然高保真Pfu DNA聚合酶PCR显示出了同纳米PCR一样的扩增特异性,但纳米PCR不仅能表现出较高的扩增特异性,而且还显示出了更好的扩增效率.并且,纳米PCR即使是在30 ℃的低退火温度下依旧能扩增出特异性     

RAPD-PCR技术及其在昆虫学研究中的应用综述

聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,简称 PCR)技术是一项可在生物体外对特定 DNA序列进行快速扩增的新技术。随机扩增的多态性 DNA技术 (Random amplified polymorphic DNA,简称 RAPD)是一项基于 PCR技术上的 DNA分子水平上的大分子多态检测技术。本文对该技术在昆虫学研究领域的应用状况做了一个系统的收集和整理 ,认为它在昆虫分类、系统进化、抗药性机理及抗性基因检测等方面的研究中具有着广泛的应用前景 ,而且它的应用前景随着技术和统计方法的完善将更加广阔。     

DNA检测方法在鱼类物种鉴定中的应用

总结了近年来在鱼类物种鉴定中常用的DNA序列分析、DNA指纹技术、物种特异性聚合酶链式反应和实时荧光PCR技术等DNA检测方法,同时对各类方法的特点和局限性进行了分析．     

重组Tth DNA聚合酶基因的克隆表达及活性鉴定

Tth DNA聚合酶具有聚合酶与反转录酶两种功能,而且耐高温,但是国内并未实现高效生产.本研究以粗提的嗜热栖热菌Thermus thermophilus基因组为模板,采用PCR分段扩增和酶切连接的方法获得Tth DNA聚合酶基因全长序列;然后构建重组质粒pXT99b/Tth并转化表达菌E.coli DH5α,利用IPTG诱导Tth基因表达,并采用热处理、Ni2+柱纯化融合His-tag的Tth DNA聚合酶,最后利用PCR、RT-PCR鉴定其活性.结果显示,本研究获得Tth DNA聚合酶基因全长2 505bp,成功表达并获得高纯度高活性的重组Tth DNA聚合酶,1L发酵液所得粗酶液中,酶活性约有800 000U,酶的比活约为6 315U/mg.本研究最终实现了Tth DNA聚合酶的高效国产化并降低了实验成本.     

聚合酶链反应检测石蜡切片中金黄色葡萄球菌DNA的研究

目的　探讨聚合酶链反应技术 (PCR)在检测石蜡包埋组织中金黄色葡萄球菌DNA的应用及价值。方法　利用PCR技术 ,对 55例福尔马林固定、石蜡包埋小鼠组织中SA DNA进行了检测。结果　 55例石蜡包埋的小鼠组织中均检测到SA DNA ,这与临床病理诊断为金黄色葡萄球菌 (S .aureus)感染相一致。结论　PCR技术可用于检测石蜡包埋组织中的SA DNA片段 ,为鼠S .aureus感染的回顾性分析提供了有效手段     

DNA体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)

PcR(PolymeraseChainReaction)译为聚合酶链式反应,是近年来发展起来的一种DNA体外扩增技术．具有快速,简便和特异性强的优点,在分子生物学研究方面的应用具有广阔的前景．本文简要介绍了PCR技术的原理,影响因素及其应用．     

Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化

来源于Pyrococcus furiosus COM1菌的Pfu DNA聚合酶具有保真性高、延伸速度快、热稳定性强等特点,能够提高PCR反应过程中的扩增效率,减少错误碱基掺入率.以大肠杆菌Rosetta(DE3)为重组细胞,利用一种快速表达纯化方法,让Pfu DNA聚合酶的表达纯化过程变得更加简便,并维持其高活性.结果表明,Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中能够进行大量表达,同时60℃高温水浴能有效去除杂蛋白,简化纯化步骤及提高Pfu DNA聚合酶纯度.经过一系列纯化步骤处理后,Pfu DNA聚合酶仍然能够保持较好的酶活,且在100μL PCR反应体系中,加入4μL的1 mg/mL Pfu DNA聚合酶液效果最佳.     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.