人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究

<正>将来源于黑松、马尾松的松材线虫分别用单异活体法和无异活体法人工培养后,以不同方法和不同溶剂对培养物进行提取,并用粗提浓缩液对３０ｄ以上生的黑松和马尾松幼苗做生物测定。结果表明,在人工培养条件下松材线虫无致萎毒素产生     

松材线虫携带细菌的鉴定和毒性研究

从松材线虫病致死的松材木质部和松材线虫体表分离到3个出现频率较高的细菌菌株，菌株Nji、Njt和Njw。经鉴定3种细菌分别为荧光假单胞菌I型（Pseudomonas fluorescens biotype I)荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biotype Ⅱ）和泛菌属某种（Pantoea sp.)。用牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡培养细菌，培养液直接处理黑松愈伤组织，测定各细菌的产毒能力。与对照（空白培养液）相比，3种细菌的培养原液都可对黑松愈伤组织产生明显影响，其中菌株Nih和菌株Njt可以在2d内使愈伤组织明显变色，菌株Njw处理变色较慢。表明菌株Nij和Njt培养液内有大量致萎毒性物质存在。     

松材线虫和拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究

目前松材线虫的致病机理尚不明确,其食道腺可能在致病过程中起重要作用。文章介绍了松材线虫的寄生方式及其致病机理,并对松材线虫与拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究进行了文献的整理和分析。     

无菌松材线虫的获得及培养方法研究

采用不同浓度的H2O2和抗菌素处理松材线虫虫卵和松材线虫虫体,筛选松材线虫无菌化处理有效途径.多种方法的比较表明,采用高浓度抗菌素和低浓度H2O2交替并反复处理松材线虫虫体,获得无菌线虫的比例高,线虫生命力强.将获得的无菌松材线虫与带菌线虫分别用PSA和玉米粒上培养的灰葡萄孢进行人工培养,发现线虫生长繁殖情况无明显差异.     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。     

松材线虫分离及不同真菌对松材线虫繁殖的影响

主要对松材线虫的取样分离进行探索,并初步研究了以真菌作为食料培养松材线虫。结果表明：取样部位对分离效果有影响,蛀孔及蛹室周围分离到的线虫量明显比枝条及树干其他部位多;不同真菌培养松材线虫效果有差异,主要采用了灰葡萄孢、黄瓜镰刀菌和香蕉镰刀菌3种真菌,通过设计不同影响因素比较培养效果,发现灰葡萄孢培养效果较为稳定且最佳,其次是黄瓜镰刀菌。因此,灰葡萄孢和黄瓜镰刀菌可选用于培养松材线虫。     

具杀松材线虫活性的解淀粉芽孢杆菌 JKJS3的培养条件

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JKJS3菌株分离自马尾松林,对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高的杀线活性。为进一步开发和应用该菌株,以松材线虫为测试靶标,对JKJS3菌株分泌杀线活性物质的适宜培养基和培养条件进行了研究。结果表明：不同碳源组分的培养基对JKJS3菌株分泌杀线活性物质无显著影响,而不同氮源对其有显著影响,其中以氮源为5 g/L牛肉膏和6 g/L蛋白胨组成的培养基所获培养滤液的杀线活性最高,为实验室条件下菌株分泌杀线活性物质的最适培养基;JKJS3菌株的最佳培养条件为初始pH=7、培养温度为37 ℃和无光照振荡培养;该菌株分泌杀线活性物质较理想的培养时间为10 d。     

一种新的杀线虫担子菌

YL14是一种首次发现具杀线虫活性的担子菌,12h内对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus)的致病率达90％以上,是一株有应用前景的线虫生防菌。本试验观察了该菌对线虫的致病过程,证明其杀线虫机制是产生杀线虫毒素。经液体发酵,活性组分存在于发酵液中,不需线虫诱导能稳定生成,为水溶性,对热不敏感。     

黑松与松材线虫和拟松材线虫互作早期超氧自由基研究

为探讨黑松受不同毒力松材线虫与无毒拟松材线虫侵染后,超氧自由基(O2.-)在互作早期对松材线虫病发生发展的作用,采用2年生黑松接种强毒、弱毒松材线虫与无毒拟松材线虫,于接种后4、12、24、48、72、96、120 h对受侵染黑松的茎干和针叶取样测定。结果表明:黑松受不同毒力供试线虫侵染后体内O2.-和SOD活性变化差异显著。接种后12 h,松树茎、叶中的O2.-均出现第1次突增,茎部突增的强度与供试线虫毒力呈负相关,在针叶内O2.-出现第2次突增,且无毒拟松材线虫处理(48 h)的启动时间早于强毒松材线虫(72 h)的。SOD活性在接种无毒拟松材线虫的松树茎、叶中出现两次突增,而接种强毒松材线虫的处理仅出现1次突增。3种处理黑松茎、叶的Mn-SOD含量在24 h后第1次突增,且接种无毒拟松材线虫的高于接种强毒松材线虫的。O2.-与SOD的变化趋势在一定程度上呈正相关关系,但SOD的特异变化滞后于O2.-的变化。由此可见,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后进行信号转导的重要桥梁物质。     

松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。     

土壤真菌培养物对松材线虫生长和繁殖抑制作用的研究

从土壤分离的９９株真菌以ＰＳＭ培养基培养，检测其培养物对松材线虫生长和繁殖的抑制作用，结果发现１８号菌株显示了极强的抗线虫活性，经初步分析其活性成分为水溶性的中性物质。     

松材线虫携带细菌数量的测定及无菌松材线虫的培养

对来源于自然条件和常规培养条件下的松材线虫携带的细菌数量进行了测定 ,并采用黑松愈伤组织对松材线虫进行了纯培养。结果表明 ,自然感病的黑松病组织中的松材线虫携带活细菌的数量平均为 2 .9× 10 2 个 条 ,灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为 3.0× 10 3 个 条 ;来源于自然感病的黑松和马尾松上的松材线虫 ,经无菌处理后 ,在黑松愈伤组织上生长良好 ,用 3g新鲜愈伤组织培养 9d ,虫口数量可达 10万余条。     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

松褐天牛传递松材线虫数量的研究

松褐天牛从取食开始到试验结束（50d），将松材线虫通过补充营养伤口传递到健康松树，取食到20d时传递的数量最多，每头694条，到第30天数量较多，在此之前和之后数量较少，每头100条左右。松褐天牛将60％的松材线虫传递到当年生树树，随着树枝年龄增加，传递数量减少。实验室和林间试验分离分离测计表明，松褐天牛的身体仍残留一定数量的松材线虫。     

不同线虫在黑松体内的扩展速度与致病性

分别用强、弱致病力松材线虫和无致病力拟松材线虫接种2年生黑松苗.观察结果表明:强致病力松材线虫在黑松体内扩散速度较快,4 d针叶开始发黄,7d松苗新梢开始萎蔫下垂,10 d松苗萎蔫,线虫在松苗体内大量繁殖,超过接种时的线虫数;弱致病力松材线虫在黑松体内扩散速度较慢,7 d针叶出现发黄的迹象,15 d新梢开始蒌蔫,25 d松苗整株萎蔫,线虫数量开始增加,超过接种时的线虫数;无致病力拟松材线虫接种后7 d仅在树梢分离到少量线虫,梢部部分针叶发黄,之后线虫基本未繁殖,25 d松苗体内已分离不到线虫,梢部针叶症状未加剧,松苗生长与对照类似.因此,黑松感染线虫后,是否发病与线虫能否在松苗体内存活有关,发病速度快慢与线虫在松苗体内扩散速度及能否大量繁殖有直接关系.     

沙冬青和骆驼蓬水煮提取物对松材线虫的毒杀作用

以采自内蒙古鸟海市的沙冬青及骆驼蓬为植物材料,研究其提取物对松材线虫的生物活性．将水煮浓缩膏与线虫液分别混合配制成浓度为12,6,3,1．5,1,0．5,0．25和0．125g／L的线虫药液,每日统计线虫死亡率．结果显示,沙冬青的杀虫活性好于骆驼蓬;沙冬青药液浓度在1g／L及以上都有杀虫效果,骆驼蓬药液浓度在6g／L及以上有较好的杀虫效果;沙冬青和骆驼蓬处理松材线虫1d后的半致死浓度分别为0．56和1．39g／L．     

沙冬青和骆驼蓬水煮提取物对松材线虫的毒杀作用

以采自内蒙古鸟海市的沙冬青及骆驼蓬为植物材料,研究其提取物对松材线虫的生物活性．将水煮浓缩膏与线虫液分别混合配制成浓度为12,6,3,1．5,1,0．5,0．25和0．125g／L的线虫药液,每日统计线虫死亡率．结果显示,沙冬青的杀虫活性好于骆驼蓬;沙冬青药液浓度在1g／L及以上都有杀虫效果,骆驼蓬药液浓度在6g／L及以上有较好的杀虫效果;沙冬青和骆驼蓬处理松材线虫1d后的半致死浓度分别为0．56和1．39g／L．     

四合木甲醇提取物中杀线虫物质的分离与活性鉴定

通过活性追踪，对四合木的甲醇提取物活性成分进行了初步分离，使用快速制备色谱（combiflash companion）对甲醇提取物的氯仿萃取相进行了进一步分离，得到18个较大的馏分，同时以松材线虫（Bursa phelenchus xylophilus）为供试对象，对各馏分杀线虫活性作了初步测定，结果表明：氯仿萃取相F4馏分有较强的杀线虫活性，具有进一步研究的价值．     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。