产辅酶Q10的类球红细菌原生质体制备和再生研究

 辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是人类细胞自身产生的内源性辅酶因子,是一类天然抗氧化剂,目前已广泛应用于医药、食品、化妆品等诸多领域.基因组改组技术的核心内容为原生质体融合,为了提高基因组改组的效率,提高辅酶Q₁₀的产量,本研究对产辅酶Q₁₀的类球红细菌原生质体制备及再生条件进行了优化,通过生长曲线、正交试验等确定了原生质体制备及再生的适宜条件：溶菌酶浓度1mg/mL、作用温度37℃、作用时间1h以及再生培养基蔗糖浓度10%.在此条件下,类球红细菌原生质体形成率可达到96.1%,再生率可达到28.8%.这为进一步对该菌的基因组改组研究奠定了基础.     

过量表达dxsA提高类球红细菌辅酶Q_(10)产量研究

利用PCR扩增了辅酶Q_(10)生物合成过程中重要酶基因dxsA,并连接到pRKpuf载体获得了过量表达dxsA的表达载体pRKdxsA;利用接合转移技术将表达载体pRKdxsA转移到类球红细菌2.4.1中构建了过量表达dxsA的类球红细菌基因工程菌2.4.1/pRKdxsA.微氧诱导表达后,基因工程菌2.4.1/pRKdxsA辅酶Q_(10)的产量提高了约40%.定量PCR分析表明,基因工程菌2.4.1/pRKdxsA中dxsA mRNA表达水平较对照菌2.4.1/pRKpuf显著上调.抑菌圈试验表明,与对照菌2.4.1/pRKpuf相比,基因工程菌2.4.1/pRKdxsA对H_2O_2更不敏感.研究结论为利用类球红细菌工业化生产天然辅酶Q_(10)提供了技术支持.     

利用空间诱变选育辅酶Q10高产菌

 以空间搭载为诱变手段,筛选可用于工业化生产的辅酶Q10高产菌株。以类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）为出发菌株进行空间搭载,根据菌落形态进行初筛,摇瓶发酵进行复筛,HPLC检测含量等方法筛选辅酶Q10高产菌株。最终得到名为Shenzhou6的突变株产量比对照菌株提高30％,产量可达（0.8+0.02）g/L,经过优化培养可满足工业生产需要。同时也说明空间诱变因其复杂的空间环境条件,可以作为一种诱变手段进行工业化菌样的筛选。     

超声波破碎法提取辅酶Q10研究

利用超声波破碎法提取类球红细菌辅酶Q10,通过单因素实验及正交实验,获得最佳工作条件.实验结果表明:超声波器输出功率为195W,每次工作时间/间歇时间为4s/5s,工作总时间为4.5min,处理菌悬液OD600为0.640为最佳工作条件.采用优化后的超声波提取工艺,辅酶Q10提取量可达到1.524 mg/g.     

利用基因组改组技术提高辅酶Q10产量

 辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是生物细胞呼吸链中的重要递氢体,已广泛应用于心脏病、肝炎、帕金森症等多种疾病的治疗中.为了提高微生物法生产CoQ₁₀的产量,本文利用基因组改组技术选育类球红细菌辅酶Q₁₀高产菌株.根据CoQ₁₀的合成途径及作用机理,确定了不同的抗性筛选标记物：罗红霉素、卡那霉素、对羟基苯甲酸、维生素K3和硫化钠.根据类球红细菌对标记物的耐受性确定了抗性筛选浓度.通过紫外线、紫外线/氯化锂、硫酸二乙酯、微波及钴60 5种诱变方式以及抗性培养基筛选获得了9株改良的突变株作为出发菌株.通过一轮基因组改组得到了几株高产菌株,其中PN13产CoQ₁₀的量可达到2.39mg/g,是原菌的2.52倍.     

产辅酶Q10大肠杆菌工程菌的构建

克隆放射型根瘤菌ddsA基因,用于构建red重组的打靶片段,通过同源重组替换大肠杆菌基因组上的ispB基因,使合成辅酶Q8的大肠杆菌具备合成辅酶Q10的能力.通过强化辅酶Q合成过程中的ddsA、ubiA、ispA、idi等关键酶基因,可使大肠杆菌辅酶Q10的合成能力提高126.9%.综合分析表明,ddsA与ubiA为辅酶Q10合成的关键基因,ispA与idi为辅酶Q10合成的次关键基因.     

等离子体作用结合氧限制模型选育辅酶Q10高产菌株

将常温常压等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变和无水亚硫酸钠构建的氧限制筛选模型相结合,通过适合辅酶Q10生产菌株的24孔板高通量快速培养技术,选育了类球红细菌Rhodobacter sphaeroides耐氧限的高性能突变株.实验结果表明:该菌株诱变...     

沼泽红假单胞菌高产辅酶Q10菌株的诱变选育研究

以沼泽红假单胞菌为出发菌株,通过紫外诱变和罗红霉素抗性筛选,以期获得辅酶Q10高产菌株.试验结果表明,紫外照射时间60-70s时可能达到最大正向突变概率.通过紫外诱变、罗红霉素初筛和发酵复筛,获得一株沼泽红假单胞菌突变株R-1,辅酶Q10产量达到0.021g/L,较出发菌株产量（0.018g/L）提高16％.经过6次传代培养,突变菌株产辅酶Q10产量稳定,可用于进一步研究.     

纳米TiO2对土壤中氮转化相关细菌活性的影响

采用盆栽实验方法研究了不同土壤类型、不同纳米TiO_2浓度和是否种植植物条件下的纳米TiO_2对土壤中氮转化相关细菌活性的影响。结果发现,纳米TiO_2对土壤中氨化细菌,硝化细菌和自生固氮菌的活性均产生抑制作用,抑菌率随着培养时间呈现先升高后降低的趋势,在各个采样时间下抑菌率均随着纳米TiO_2浓度的增加而增加,而且在不同类型土壤中纳米TiO_2的抑制作用大小顺序是沙土黑土草炭土,并且种植紫花苜蓿可以减轻纳米TiO_2对细菌的抑制效果。在涉及到的实验时间和纳米TiO_2的浓度范围等相关研究中,纳米TiO_2对反硝化细菌活性的影响效果不明显。