人白细胞介素32的真核表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要:目的：构建人白细胞介素32（IL-32）和IgG4基因Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO/DG44）克隆,并检测重组蛋白的表达及相应的生物学功能.方法：采用聚合酶链反应(PCR)从LPS激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32基因,并克隆到构建IL-32融合基因的真核表达载体 IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC.经脂质体法转染CHO/DG44 细胞, 通过RT-PCR检测,筛选出实验组细胞,并对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤（MTX）加压筛选,利用ProteinG-Agarose亲和纯化培养上清中表达的融合蛋白,并通过SDS-PAGE、免疫印迹鉴定检测目的蛋白的表达,最后以 HeLa细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果：构建了一个IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC;筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆; 亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白在SDS-PAGE电泳后与预期分子质量大小相符,能够与羊抗人IgG-HRP 抗体特异结合,并能促进HeLa细胞的死亡.结论：成功构建了人IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆.     

靶标替换消减SELEX技术筛选小鼠IgG Fc片段的DNA配基及其活性鉴定

建立高特异性和亲和力的小鼠IgG Fc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的Fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配基进行活性鉴定.经过16轮筛选,得到了与小...     

矽肺病人的免疫状态

本文检查了矽肺病人的多种免疫状态,发现患者同围血中T细胞百分率平均值比对照组显著降低,而B细胞百分率呈有意义增高;血清蛋白、r、α_1、α_2球蛋白有随病程进展而增高趋势;血清免疫球蛋白IgG和IgA含量的增高亦与病程相一致,至Ⅱ期矽肺二者含量增高显著,但IgM含量未见明显变化,仅在矽肺合并结核组,IgG、IgA、和IgM含量呈明显增高;患者组类风湿因子(RF)和抗核抗体(ANA)合并阳性率(24.5％)比接尘组(13.3％)为高;血中循环免疫复合物(CIC)阳性检出率较高,但Ⅰ期矽肺组与对照组相比,未呈统计学差别;患者血中总补体(CH_(50))和C_8含量未见明显变化。根据患者的T细胞检出率降低,B细胞增高、体液免疫结果与细胞免疫相一致,均和病程进展而呈现规律性变化,以及自身抗体增高等免疫现象,似与自身免疲性疾病有类同之处。随着杂交瘤技术的广泛应用,联系近年国外关于石棉肺免疫学研究,对T细胞亚群变化进行了讨论,这方面的深入研究,对阐明矽肺发病机理是有意义的。对矽肺免疫的进一步研究,从实验设计上也提出了有益的建议。     

蛋白质芯片与ELISA在人IgG定量分析中的比较

建立定量检测人血清IgG (immunoglobulin,IgG)蛋白质芯片,并与酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测的结果进行比较. 将纯化的羊抗人IgG 0.5 mg/mL 30%甘油/PBS,点样在经硝酸纤维素修饰的片基上,以人血清白蛋白为阴性对照,用1% BSA封闭,制备定量检测人血清IgG的蛋白质芯片;同时用ELISA检测人血清IgG. SPSS 10.0软件分析蛋白质芯片和ELISA的试验结果,采用单因素方差分析两组间相关性. 结果显示蛋白质芯片和ELISA校准曲线的 R2值分别是0.996和0.994. 两种方法检测的10例人血清IgG含量,其检测限均在1.56 μg/100 μL. 用单因素方差分析结果显示 f＝0.188,P=0.670＞0.05,表明两组间差异无显著性意义,具有很好的一致性.     

东方田鼠抗日本血吸虫病机制研究

本文报道了在东方田鼠抗日本血吸虫机制研究方面的研究成果。经多次重复感染试验 ,证实来源于血吸虫疫区 (洞庭湖 )和非疫区 (宁夏青铜峡 )的东方田鼠均具有抗日本血吸虫病能力 ,这种能力是可遗传的 ,与获得性免疫关系不大 ;体内外的检测与杀伤试验显示东方田鼠体内存在的抗日本血吸虫童虫和成虫抗原的天然抗体IgG3和补体可能在其抗血吸虫病方面具有很重要的作用 ;东方田鼠和腹腔巨噬细胞 (Mф)、嗜酸细胞 (Eos)对血吸虫童虫具有天然的黏附能力 ;用东方田鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,获得了 5个阳性克隆 ,其中 4个克隆为新基因 ,…     

高通量、多组分表面等离子体谐振生化分析系统研究

基于表面等离子体谐振(surface plasmon resonance,SPR)原理,利用图像分析技术和自动进样技术,研制成一种新型高通量、多组分图像SPR生化分析系统;对微阵列SPR敏感芯片进行动态检测,实现高通量、多参数、多组分快速检测和定量分析．以15单元的阵列芯片为例,对兔IgG和人IgG分别与羊抗兔IgG和羊抗人IgG的免疫结合反应进行了实验检测．结果表明,该分析系统可进行实时高通量、多参数检测,具有灵敏度高、免标记等优点,而且阵列芯片中所设置的参比单元可以消除溶液本体折射率和温度变化的影响,提高了测量精度和准确性;另外芯片可以再生重复使用,降低了测试成本．     

非特异性IgG含量对EIA法检测抗-HCV抗体的干扰现象

用酶免疫分析法(EIA)研究了人血清非特异性IgG 在抗-HCV抗体检测中的干扰作用.结果显示:随着正常健康人血清标本(阴性血清)中I gG量的增加,其OD值随之增高,当标本中的IgG含量增加至一定值时即产生假阳性结果.此结果表明非特异性IgG与支持材料(酶标板)非特异性结合可造成对EIA实验结果的干扰作用.这就解释了一些学者报导类风湿性关节炎、自身免疫性肝病、高血清免疫球蛋白血症等患者用EIA法检测抗-HCV时易出现假阳性的原因.     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

慢性粒细胞白血病患者FcεRⅠγ链基因表达上调

目的:在慢性粒细胞白血病病人(CML),CD3ζ链表达明显下降,分析与CD3ζ存在互补关系的FcεRⅠγ基因在CML患者中表达水平,以了解T细胞免疫中TCR信号转导的变化情况.方法:利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR法测定CML患者和健康人各20例的外周血单个核细胞(PBMCs)的FcεRⅠγ基因表达水平,以β2微球蛋白基因(β2MG)作为内参照,采用相对定量公式:2-△Ct×100％,计算FcεRⅠγ链的相对mRNA表达量.结果:CML患者PBMCs中FcεRⅠγ基因表达水平明显高于健康对照组(P＜0.001).FcεRⅠ γ表达水平变化与病人外周血CD3+T细胞比例无相关性.结论:CML病人中FcεRⅠ γ表达上升,提示FcεRⅠγ可能在一定程度调节CD3ζ链缺陷所带来的T细胞免疫异常.     

MCTD、SS和RA患者血清中SARS-CoV抗体阳性原因分析

为探讨严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)抗体在SARS病原学诊断中的特异性及其在干燥综合征(SS)、混合结缔组织病(MCTD)和类风湿性关节炎(RA)患者血清中的假阳性问题，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光法(IFA)检测了111例正常对照和46例SS、MCTD和RA患者血清中SARS-CoV抗体的阳性率。结果在正常对照和SS、MCTD和RA患者中，应用ELISA测定SARS-CoV抗体的阳性率分别为3．6％(4／111)和19．6％(9／46)，经IFA检测，上述SARS-CoV抗体阳性者均为阴性。提示IFA诊断SARS的特异性为100％，ELISA诊断SARS存在一定的假阳性。     

脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗体胶体金检测试纸条的研制

目的:为研制快速检测脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗体的胶体金试纸条.方法:以辛酸-硫酸铵沉淀法纯化脊髓灰质炎病毒Ⅰ型单克隆抗体,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,胶体金标记单抗,再结合脊灰病毒抗原形成复合物,固定于金标垫上,将鼠抗人IgG和羊抗鼠IgG分别包被于试纸条的T (检测线)处和C (质控线)处,应用该试纸条进行性能检测.结果:以已知的脊灰病毒Ⅰ型阳性血清作为检测样品,试纸条检测的灵敏度为1:80;特异性试验证明该试纸条与甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、麻疹病毒抗体阳性血清没有交叉反应;检测结果与脊灰病毒Ⅰ型疫苗抗体检测试剂盒(ELISA)试验的符合率为86.7%.结论:该试纸条检测脊灰病毒Ⅰ型的抗体水平具有较好的特异性与灵敏性,适用于大规模临床血清抗体水平检测,具有良好的应用前景.     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.     

牛羊细粒棘球蚴病现场快速检测方法的建立及应用

建立了一种基于恒温隔绝PCR(Insulated isothermal PCR,ii PCR)技术现场检测牛羊包虫病的方法.结果显示,该方法只能检出细粒棘球绦虫,对多房棘球绦虫、肝片吸虫、细颈囊尾蚴、前后盘吸虫、日本血吸虫、金黄色葡萄球菌、伪结核杆菌无关病原不检出;检测下限为100个拷贝,重复性好.对55份牦牛源包囊样本和70份羊源包囊样本的检出率分别为61.8和4.3%,与文献报道的检测方法的符合率分别为100%;本研究建立的ii PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,从核酸提取到报告检测结果仅需1小时,操作方便,可现场使用,为牛羊包虫病的现场快速诊断提供有力的工具.     

鸡传染性支气管炎病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制

[目的]建立一种快速、灵敏的胶体金免疫层析法(Colloidal-gold immunochromatography assay),用以检测禽类早期感染鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)和监测IBV疫苗接种免疫水平.[方法]将重组IBV核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白包被在在试纸条检测线,羊抗兔IgG包被在试纸条控制线,用胶体金-兔抗鸡IgG偶联物作为示踪剂,检测血清中IBV抗体.[结果]制备所得的胶体金免疫层析试纸条与IBV抗体阳性血清反应呈阳性,与鸡新城疫病毒抗体阳性血清、鸡传染性法氏囊病毒抗体阳性血清、鸡毒霉形体抗体阳性血清和SPF标准鸡血清未发生交叉反应;当IBV抗体阳性血清以1:35比例稀释后,依然可以用该试纸条检出;该试纸条在60 d的保存期内重复性良好;以从不同养殖场采集到的鸡血清样本作为测试对象,比较该试纸条和进口 ELISA试剂盒的检测结果,两者符合率为97.44％.[结论]成功制备了检测耗时短、检测限低、特异性强、稳定性好的IBV抗体检测胶体金免疫层析试纸条,为鸡传染性支气管炎的早期诊断以及免疫监测提供了简便高效的技术方法.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

设计了一对特异性引物,对16头临床症状、病理变化和ELISA检测呈阳性的猪繁殖与呼吸障碍综合征疑似病例的肺脏、脾脏和淋巴结以及种公猪的精液进行了RT-PCR扩增。结果显示16头样品的相应组织及精液都扩增出特异性基因片段,阳性符合率为100%,8头猪繁殖与呼吸障碍综合征血清ELISA检测为阴性的对照样品中有2头扩增出阳性片段,检出率为25%。RT-PCR检测方法的建立为猪繁殖与呼吸障碍综合征的准确诊断提供了技术手段。     

聚合酶链反应检测脐血及乳汁中乙型肝炎病毒DNA

应用聚合酶链反应(PCR)技术对乙肝病毒(HBV)血清学指标一项或多项阳性的产妇检测其脐血及乳汁中乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV—DNA)。31名产妇共采集脐血标本20份,乳汁标本31份,有脐血标本者同时有乳汁标本,另11人仅有乳汁标本。检测结果:脐血中HBV—DNA阳性8例,阳性率40％;乳汁标本中HBV—DNA阳性11例,阳性率35.5％;脐血、乳汁双阳性4例,占20％。其中抗原阳性组检出率脐血46.5％,乳汁26.66％。结论:乙肝病毒可以垂直传播,也可通过乳汁传播;抗原阳性者传染性强于抗体阳性者;任何一项HBV血清学指标阳性均可能在脐血及乳汁中检出HBV—DNA。     

表面等离子共振生物传感器测定人免疫球蛋白的抗原活性

目的:研究人免疫球蛋白质与羧甲基葡聚糖的氨基偶联及其与其他蛋白质的特异结合作用。方法:测定不同条件下人免疫球蛋白G(IgG)在羧甲基葡聚糖表面静电吸附的影响,并采用氨基偶联的方法,将其交联固定于葡聚糖表面,测定其与羊抗人IgG的特异结合。结果:pH及离子强度对蛋白质在羧甲基葡聚糖表面静电吸附有较大的影响,流体速度控制蛋白质的静电吸附动力学过程,并对其静电吸附量产生影响,其与羊抗人IgG有很强的特异结合作用,表现为快结合慢解离的动力学过程。结论:3.0相似文献   

微波ELISA法在日本血吸虫病流行区现场应用的初步观察

目的观察微波ELISA在日本血吸虫病流行区现场的应用价值。方法用微波ELISA和快速ELISA对江西203例有疫水接触史患者的血清进行检测。结果微波ELISA抗体阳性检出率为12.3%(25/203),快速ELISA为13.3%(27/203)(2χ=0.088,P>0.05),61例杭州市区正常人血清,微波ELISA阳性检出率为3.3%,快速ELISA阳性检出率为1.6%(2χ=0.34,P>0.05),两法无显著性差异。结论微波ELISA与快速ELISA检测日本血吸虫病抗体的敏感性和特异性相近,可应用于血吸虫病的流行病学调查。     

CMIA在梅毒特异性诊断中的临床应用价值

目的探讨全自动微粒子化学发光免疫法(CMIA)在梅毒特异性抗体筛查中的临床应用价值。方法收集疑似梅毒病例血清标本396份,分别采用CMIA、明胶颗粒凝集试验(TPPA)和蛋白质印迹法(Western blotting,WB)对标本进行梅毒特异性抗体检测,以蛋白质印迹法为金标准,比较CMIA和TPPA的敏感度与特异性。采用SPSS 20.0统计学软件绘制ROC曲线,计算得出本实验室梅毒特异性抗体S/CO的最佳临界值。结果在396份血清样本中,以WB结果为梅毒特异性抗体检测金标准,CMIA的敏感度为100%,特异性为88.9%,阳性预测值为87.1%,阴性预测值为100%,与WB的总符合率为93.7%;TPPA的敏感度为96.4%,特异性为91.2%,阳性预测值为89.1%,阴性预测值为97.2%,与WB的总符合率为93.4%。ROC曲线分析得出梅毒特异性抗体S/CO比值为3.42时,CMIA的特异性达到98.57%,敏感度为97.71%,具有的诊断价值最高。结论 CMIA检测梅毒螺旋体特异性抗体具有高敏感度和特异性,与TPPA比较优势明显,可作为临床上梅毒特异性抗体大批量血清学检测的首选方法。当CMIA的S/CO≤1.0或≥3.42时,可直接报告结果,节约医疗成本;当CMIA的S/CO为1.00～3.42时,可加做WB确证试验以提高检测结果的可靠性和准确性。     

CagA阳性幽门螺杆菌感染与消化性溃疡、胃炎相关性512例临床分析

目的探讨CagA阳性Hp感染与消化性溃疡、胃炎等胃及十二指肠疾病的关系.方法采用ELISA法对Hp阳性(~(13)C-呼气试验为阳性)、胃黏膜快速尿素酶联免疫法阳性的512例胃十二指肠疾病患者及80例对照者(健康体检:~(13)C-呼气试验为阴性、胃黏膜快速尿素酶联免疫法阴性)行血清CagA抗体检测.512例胃十二指肠疾病患者中慢性浅表性胃炎(CSG)184例,慢性萎缩性胃炎(CAG)120例,十二指肠球溃疡(DU)100例,胃溃疡(GU)108例.结果 CagA抗体阳性检出率对照组为30%,慢性浅表性胃炎组阳性率为61.96%,慢性萎缩性胃炎组阳性率为63.33,十二指肠溃疡组阳性率为68.00%,胃溃疡组阳性率为74.07%.胃十二指肠疾病患者CagA阳性总检出率为66.02%,与对照组比较,差异具有统计学意义(P0.05).结论胃十二指肠疾病Hp阳性感染者中CagA抗体阳性总检出率明显高于对照组,提示CagA抗体阳性感染与胃十二指肠疾病密切相关;两组胃炎患者CagA抗体阳性检出率明显高于对照组,提示CagA抗体阳性感染与胃炎密切相关;胃十二指肠溃疡患者CagA抗体阳性检出率明显高于对照组,提示CagA抗体阳性感染与消化性溃疡密切相关.